建立用于嗜神经病毒抗病毒筛选的人体外血脑屏障模型

《Fluids and Barriers of the CNS》：Establishment of an in vitro human blood-brain barrier model for antiviral screening against neurotropic viruses

　　

摘要 背景：嗜神经病毒（neurotropic viruses）感染中枢神经系统（central nervous system，CNS）会导致严重的神经学及长期并发症，包括永久性认知障碍。然而，对于许多此类嗜神经病毒，如蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV），尚无临床获批的抗病毒药物。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）既是嗜神经病毒的关键入侵门户，也是药物递送至大脑的屏障。为帮助识别可穿透BBB的抗病毒药物，研究人员建立了一种BBB渗透性抗病毒筛选检测方法（BBB-permeable antiviral screening assay，BASA）。 方法：BASA将抗病毒检测与一种体外BBB Transwell模型相结合，该模型由原代人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）和周细胞（human brain microvascular pericytes，HBMVP）构成。将该体外BBB Transwell模型与富含星形胶质细胞的培养物结合，提供了一个用于研究TBEV在BBB处感染的三重细胞培养模型。 结果：通过测试已知具有CNS穿透特性的临床获批抗人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）药物，验证了BASA用于识别可穿透BBB的抗病毒药物的适用性。感染实验揭示，TBEV能够穿越完整的BBB以感染星形胶质细胞靶细胞。通过应用BASA，研究人员鉴定出一种新型的可穿透BBB的抗TBEV化合物（化合物3d）。 结论：研究人员建立了一个模块化检测系统，用于早期评估新型抗病毒化合物的CNS穿透潜力。像本研究中开发的这类工具，有助于促进针对嗜神经病毒的专用治疗药物的早期临床前优化，同时减少动物实验的需求。

研究背景、现存问题与研究目的

嗜神经病毒（neurotropic viruses）是一类能够感染中枢神经系统（central nervous system，CNS）的病毒，常导致严重的神经炎症，临床上表现为脊髓炎、脑膜炎和脑炎等，患者还可能出现包括永久性认知功能障碍在内的病毒后神经后遗症，增加疾病负担。越来越多的证据还将CNS感染与神经退行性疾病联系起来。对于许多嗜神经病毒，例如蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV），目前尚无临床获批的特异性抗病毒药物。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是维持CNS稳态的关键结构，由脑微血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞等组成，它既是嗜神经病毒进入大脑的重要门户，也是药物递送至脑实质的主要障碍。因此，迫切需要开发能够有效穿透BBB并在CNS内保持活性的抗病毒药物。为此，研究人员建立了BASA（BBB-permeable antiviral screening assay，BBB渗透性抗病毒筛选检测方法），旨在早期评估候选抗病毒化合物的CNS穿透潜力，从而加速针对嗜神经病毒的治疗药物研发。

主要关键技术方法

研究人员利用原代人脑微血管内皮细胞（HBMEC）和原代人脑微血管周细胞（HBMVP），在Transwell小室上建立了共培养的体外BBB模型。在此基础上，结合经14天分化诱导的人神经干细胞系（HNSC.100）来源的星形胶质细胞，构建了三重细胞培养模型用于TBEV感染研究。BASA采用两阶段流程：第一阶段将待测化合物加至BBB模型或空白对照小室的顶侧，24小时后收集基底侧上清；第二阶段将这些上清与病毒接种物共同加入靶细胞（HIV使用LC5-RIC报告细胞系，TBEV使用U251 MG胶质母细胞瘤细胞系），72小时后通过荧光测量、流式细胞术或RT-qPCR等方法检测病毒感染水平，以此功能性评估化合物穿透BBB后的抗病毒活性。

研究结果

体外人类BBB模型的建立：通过将HBMVP接种于Transwell小室基底侧、HBMEC接种于顶侧进行共培养72小时，成功建立了体外BBB模型。免疫荧光和流式细胞术确认了HBMEC表达CD31、HBMVP表达NG2。与HBMEC单层培养相比，HBMEC与HBMVP共培养显著降低了70 kDa FITC-葡聚糖的通透性，并显著提高了跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance，TEER），表明共培养促进了更紧密的屏障形成。

抗逆转录病毒药物验证BASA的有效性：利用已知CNS穿透效率评分（CPE score）的临床抗HIV药物对BASA进行验证。结果显示，高CPE评分的奈韦拉平（nevirapine，NEV）和阿巴卡韦（abacavir，ABC）的基底侧上清能够显著抑制HIV感染，其效果与无BBB对照组相似；而低CPE评分的沙奎那韦（saquinavir，SAQ）和恩夫韦肽（enfuvirtide，T20）则未能有效穿透BBB，其基底侧上清中的抗病毒活性显著低于无BBB对照组。这证明BASA能够功能性地区分不同BBB穿透潜力的抗病毒药物。

原代HBMEC和HNSC.100分化星形胶质细胞对TBEV感染的易感性：在单层培养感染实验中，即使在高感染复数（multiplicity of infection，MOI）下，仅有不到5%的HBMEC检测到黄病毒包膜蛋白阳性，TBEV RNA水平也较低，且未破坏细胞单层完整性。HBMVP则未检测到感染。相比之下，HNSC.100分化的星形胶质细胞对TBEV高度易感，在感染后2天即出现显著的包膜蛋白阳性和TBEV RNA水平升高，且未引起显著的细胞死亡。

TBEV在体外BBB模型中跨越屏障感染星形胶质细胞：在三重细胞培养模型中，TBEV从顶侧加入。在无BBB对照组中，星形胶质细胞在感染后2天即被大量感染；在有BBB存在的条件下，星形胶质细胞的感染延迟至感染后3天才出现显著增加。在整个感染过程中，BBB的通透性未发生显著变化，表明TBEV可能通过非破坏性机制穿越BBB。

BASA的应用揭示一种新型可穿透BBB的抗TBEV化合物：通过应用BASA，研究人员发现化合物3d（一种此前报道对寨卡病毒有抑制作用的核苷类似物）能够有效穿透BBB并在基底侧上清中保持抗TBEV活性，显著降低靶细胞U251 MG中TBEV的感染率（通过流式细胞术和RT-qPCR检测）。作为对照的利巴韦林（ribavirin，RBV）虽然也具有抗TBEV活性，但其穿透BBB后的抗病毒效果有限。此外，化合物3d暴露后的BBB通透性未见显著改变，表明其穿透并非由于破坏了屏障完整性。

总结与结论

研究人员建立并验证了一种模块化的体外BBB模型及配套的功能性筛选检测方法BASA。该平台不仅能用于评估药物穿透BBB的能力，还能同时检测其在穿过这一代谢活跃的屏障后是否仍保持抗病毒活性。通过应用BASA，研究人员首次鉴定出化合物3d是一种能够有效穿透人类BBB并对TBEV具有抑制活性的新型候选抗病毒分子。此外，利用该模型的研究还揭示了TBEV能够在保持BBB完整性的情况下穿越屏障并感染星形胶质细胞。结论指出，BASA这类工具的建立有助于促进针对嗜神经病毒治疗药物的早期临床前优化，同时有望减少动物实验的需求。