靶向DNA修复染色质修饰蛋白SMYD3：基于表观遗传学的胃癌新型治疗策略

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：Targeting the DNA-repair chromatin-modifier protein SMYD3 as a novel epigenetics-based therapy for gastric cancer

　　

背景：SMYD3是一种组蛋白甲基转移酶，与癌症进展相关，并在包括胃癌（gastric cancer, GC）在内的多种恶性肿瘤中过表达。基于先前将SMYD3与DNA损伤修复联系起来的研究证据，研究人员研究了SMYD3在GC中调控双链断裂（double-strand break, DSB）修复的分子机制，并评估了其治疗潜力。方法：研究进行了计算机模拟（in silico）和体外（in vitro）分析，以研究SMYD3与关键同源重组（homologous recombination, HR）蛋白之间的相互作用，并评估ATM介导的SMYD3磷酸化。功能实验评估了SMYD3药理学抑制对HR和非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）修复通路的影响。结果：在机制上，SMYD3与关键HR因子相互作用，并促进损伤位点的染色质重塑。ATM在苏氨酸22（threonine 22, T22）位点磷酸化SMYD3，该修饰是HR复合物组装所必需的，并在新辅助化疗后的GC患者样本中得到验证。抑制SMYD3可消除HR并部分损害NHEJ。SMYD3与PARP的联合抑制在GC细胞、肿瘤球（spheroids）和患者来源类器官（patient-derived organoids）中诱导合成致死，并克服了对奥拉帕利（olaparib）的耐药性。结论：这些发现揭示了ATM依赖的分子机制，通过该机制SMYD3调控DNA DSB修复，进一步支持SMYD3作为GC精准肿瘤学策略中有前景的治疗靶点。

胃癌（GC）是癌症相关死亡的主要原因之一，晚期诊断和化疗耐药导致患者预后差。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂已改善了治疗策略，但高度异质性的晚期GC治疗选择仍十分有限。多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂（PARPis）正在成为GC的一种有前景的策略，尤其在ATM或RAD51表达低时表现出抗肿瘤活性。SMYD3是一种在包括CRC、乳腺癌、GC等多种恶性肿瘤中高表达的组蛋白甲基转移酶，其高表达与肿瘤进展相关。已有研究将SMYD3与DNA损伤修复中的同源重组（HR）通路联系起来，但其在GC中调控DNA双链断裂（DSB）修复的分子机制尚不清楚。因此，本研究旨在阐明SMYD3调控DSB修复的具体机制，并评估单独或联合抑制SMYD3的治疗潜力。研究人员发现ATM依赖性SMYD3磷酸化促进染色质重塑和HR复合物组装，联合抑制SMYD3和PARP可在多种GC模型中诱导合成致死并克服奥拉帕利耐药。论文发表在《Journal of Experimental 》。

研究人员采用多种关键方法开展研究。利用TCGA Pan-Cancer Atlas队列（407例胃腺癌，STAD）进行临床基因组分析，结合DepMap数据库评估GC细胞系SMYD3表达；通过计算机模拟P-三肽筛选预测SMYD3相互作用蛋白，并采用共免疫沉淀（Co-IP）验证与HR蛋白的互作；使用染色质免疫沉淀（ChIP）分析DSB位点的染色质修饰和修复因子招募；通过质谱鉴定ATM磷酸化位点；利用DR-GFP报告试验和荧光素酶NHEJ报告试验评估HR和NHEJ修复效率；构建了肿瘤球模型和患者来源类器官（PDOs），其中患者正常及肿瘤组织来自IRCCS “S. De Bellis”医院，并用于ddPCR分析及PDO生成。功能实验使用SMYD3抑制剂（BCI-121、EM127）和PARP抑制剂（olaparib、rucaparib）进行联合处理。

结果部分：

SMYD3 defines a subset of GCs lacking actionable DDR alterations and interacts with HR repair proteins。TCGA队列分析显示，SMYD3高表达肿瘤（n=202）中仅25.7%携带可干预的DDR基因改变，且SMYD3高表达与PTEN、ATM、BRCA2基因改变以及ERBB2扩增、MSI-H/TMB-H、MTAP缺失显著互斥，提示SMYD3高表达肿瘤构成一类缺乏常规可干预改变的亚群。Co-IP实验证实，SMYD3与RAD50、ATM、CHK2、BRCA1、RPA32、PALB2、BRCA2和RAD51等HR蛋白形成复合物，支持其参与HR修复全过程。

Role of SMYD3 in coordinating histone modifications and DDR factor recruitment at DSBs。研究人员利用ER-AsiSI系统诱导位点特异性DSB，ChIP结果显示SMYD3富集于HR倾向的DSB位点，其药理学抑制降低了H4K20me₂、H3K9me₃和H4K16ac富集，同时增加H3K79me₂，表明SMYD3协调损伤位点的组蛋白修饰。此外，SMYD3抑制显著损害RAD50、ATM、CHK2、BRCA1、RPA32、BRCA2和RAD51在HR位点的招募，也减少53BP1在NHEJ位点的积累。NCS处理后，SMYD3抑制或敲低导致γH2AX焦点延迟消除，证实DSB修复动力学受损。

ATM-mediated SMYD3 phosphorylation promotes HR complex assembly in GC。通过多种生物信息学工具预测和质谱分析，鉴定出ATM在SMYD3苏氨酸22（T22）位点磷酸化。使用自定义磷酸化特异性抗体，研究人员证实NCS诱导的T22磷酸化依赖ATM，并在新辅助化疗后的GC患者肿瘤组织中检测到该修饰。Co-IP实验表明，T22磷酸化是SMYD3与磷酸化ATM、ATM、CHK2、BRCA2和RAD51组装所必需的；T22A突变体无法与HR蛋白结合，导致细胞增殖降低、凋亡增加，证明该修饰对HR复合物组装和细胞存活至关重要。

Targeting SMYD3 enhances the PARP inhibitors’ response in GC cell lines。DR-GFP和NHEJ报告实验显示，SMYD3敲低或药理学抑制显著降低HR效率，并部分损害NHEJ。在AGS和NCI-N87高SMYD3细胞中，EM127联合olaparib或rucaparib显著抑制增殖、增加细胞死亡和cleaved PARP水平。在奥拉帕利耐药HGC-27-OLA-R细胞中，SMYD3核表达升高，EM127恢复其奥拉帕利敏感性，表明SMYD3参与介导PARPi耐药。

Tumorsphere and patient-derived organoid models reveal the therapeutic potential of SMYD3 inhibition in GC。肿瘤球模型中，SMYD3抑制联合PARPi显著降低活力并诱导凋亡。在患者来源肿瘤类器官（PDTOs）中，来自SMYD3高表达患者（G001H-G006H）的PDTOs在联合抑制后活细胞比例显著下降，cleaved PARP水平升高，证实该联合策略在更接近体内生理状态的模型中具有翻译潜力。

讨论部分：研究人员将结果置于表观遗传治疗背景下，指出组蛋白修饰酶是重要的DDR调节因子和治疗靶点。SMYD3抑制可破坏DSB位点的染色质重塑和修复因子招募，诱导HR缺陷样状态，从而扩展PARP抑制剂在非BRCA突变GC中的应用。患者来源类器官保留了原发肿瘤的关键遗传和表观特征，为个体化治疗反应评估和生物标志物发现提供了平台。研究结论：本研究定义了一类以SMYD3过表达为特征、可干预改变有限且与关键DDR基因互斥的GC亚群，突出SMYD3作为治疗靶点的潜力。通过将PARP抑制剂的应用范围扩展至BRCA突变以外的肿瘤，SMYD3抑制可能拓宽GC治疗选择，为临床开发提供了有力依据。