重组抗原ELISA与广谱蠕虫PCR在加蓬人并殖吸虫病诊断中的临床评估

《Tropical Medicine and Health》：Clinical evaluation of recombinant antigen ELISAs and broad-range helminth PCRs for the diagnosis of human paragonimiasis in Gabon

　　

背景：并殖吸虫病是一种被忽视的食源性吸虫感染，在非洲、亚洲和美洲部分地区流行，通过食用生的或未煮熟的淡水蟹获得。肺部表现类似肺结核（TB）。诊断依赖显微镜检查，敏感性低。分子检测方法的开发受到非洲并殖吸虫物种基因组数据缺乏的限制。血清学检测依赖于粗制虫体抗原，导致可用性和可重复性受限。

方法：本研究嵌套于加蓬Lambaréné一个疑似肺结核成人前瞻性队列中。并殖吸虫病的参考标准包括痰液和粪便显微镜检查。分子待评价试验包括对痰液和粪便进行聚合酶链反应（PCR）（ITS₂、cox₁），随后测序。血清学待评价试验包括使用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的Myo-1、MDP和Egg抗原的重组酶联免疫吸附试验（ELISA）。使用阳性对照血清（3名确诊P. westermani感染者）评估诊断准确性。对粪便、尿液和血液进行检查以寻找可能发生血清学交叉反应的寄生虫。

结果：在103名参与者（于2024年9月至2025年1月入组）中，未检出并殖吸虫卵。PCR检测仅扩增出非并殖吸虫序列，包括其他蠕虫。对照血清（确诊P. westermani）显示出显著反应性，尤其对Myo-1和Egg抗原；参与者的背景反应性普遍较低。由于没有确诊的非洲并殖吸虫病病例，研究人员只能计算针对P. westermani血清的分析敏感性。探索性截断值得出初步诊断敏感性在17%至100%之间。探索性截断值产生的特异性为76%–100%，前提是参考标准未漏诊任何感染。未观察到与其他感染的相关交叉反应。

结论：在本次重组抗原ELISA用于并殖吸虫病血清学诊断的首次实际应用中，研究结果显示前景可观，尤其是Myo-1和Egg抗原。这些结果需要在更大且多样化的人群中进一步验证，包括非洲并殖吸虫物种的病例，以更好地界定加蓬及其他地区的并殖吸虫病流行病学和疾病负担。

研究背景：并殖吸虫病（paragonimiasis）是一种被忽视的食源性吸虫感染，因生食或未煮熟淡水蟹而获得，在非洲、亚洲和美洲部分地区流行。其肺部症状与肺结核（TB）极为相似，常导致误诊和不恰当的抗结核治疗。目前主要诊断方法为痰液和粪便的显微镜检查，敏感性低；分子检测因非洲Paragonimus物种基因组数据缺乏而受限；血清学检测依赖粗制虫体抗原，可重复性和可获得性差。加蓬Lambaréné地区历史上曾为P. africanus和P. uterobilateralis流行区，近期在距研究地点约60公里处发现P. uterobilateralis囊蚴，证实当地存在活跃传播循环，但人类病例已超过30年未获微生物学确认。因此，研究人员开展了一项探索性研究，评估重组Paragonimus抗原ELISA和已发表的广谱PCR靶标（cox₁、ITS₂）在疑似肺结核成人中的诊断性能，以期为该地区的并殖吸虫病负担提供证据。

主要技术方法：研究嵌套于加蓬Lambaréné两家地区医院的前瞻性疑似肺结核成人队列，于2024年9月至2025年1月纳入103名参与者。参考标准采用痰液和粪便沉淀法显微镜检查。分子检测使用针对ITS₂和cox₁区域的广谱吸虫PCR对痰液和粪便DNA进行扩增，阳性产物经Sanger测序。血清学检测采用重组抗原ELISA平台，使用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的Myo-1、MDP和Egg抗原；阳性对照为3例确诊P. westermani感染血清。同时检查粪便、尿液和血液以评估潜在交叉反应。数据分析采用均值+3/5/10标准差迭代确定截断值，并计算敏感性、特异性及95%置信区间。

研究结果：
- 参与者特征：103名参与者中，中位年龄44岁，59%为女性，29%为HIV感染者，70%居住于城市。94%有咳嗽，30%有咯血。56%报告食用淡水甲壳类，其中46%食用过螃蟹，且15%采用不安全制备方式（干燥、烟熏、腌制或生食）。27%存在嗜酸性粒细胞增多，40%检出至少一种寄生虫感染，包括类圆线虫、血吸虫、毛首鞭虫等。
- 并殖吸虫参考标准与PCR结果：痰液和粪便显微镜检查均未检出Paragonimus卵。ITS₂ PCR在17%的痰液和29%的粪便中阳性，cox₁ PCR仅在3%的粪便中阳性；所有扩增序列均未与Paragonimus匹配，而是对应其他真核生物、真菌或细菌，包括曼氏血吸虫、罗阿罗阿等。表明广谱PCR在临床样本中非特异性扩增明显，不适宜作为主要诊断工具。
- 血清学临床前验证：确诊P. westermani对照血清对Myo-1和Egg抗原呈强反应，对MDP呈中等反应；CE3抗原因对阴性对照亦有反应而于预实验阶段被弃用。
- 血清学临床队列：Myo-1抗原的阳性对照与参与者样本信号完全分离，应用探索性截断值时敏感性为100%，特异性为76%–100%；Egg抗原敏感性为78%–89%，特异性为98%–100%；MDP抗原敏感性为17%–83%，特异性为98%–100%。亚组分析显示，HIV状态、社会经济地位、城乡居住、年龄等对反应性无显著影响；潜在交叉感染亦未导致明显反应增强，仅观察到性别间统计学差异但绝对差异极小，无临床意义。

讨论与结论：这是重组Paragonimus抗原ELISA在真实风险人群中的首次前瞻性评估。Myo-1和Egg抗原表现出良好的区分能力，尤其Myo-1信号分布窄且背景低，具备进一步开发潜力。MDP因信号分布宽而未显示出稳定准确性，CE3因交叉反应不适用于高共感染负担人群。ITS₂/cox₁ PCR特异性差，但可偶然发现其他寄生虫，有助于寄生虫学监测。尽管研究未检出人类并殖吸虫病，但暴露因素普遍存在，且局部传播循环持续活跃，小样本和未覆盖儿童可能造成低流行水平的漏检。研究结论为：可重复的重组抗原血清学平台用于并殖吸虫病诊断具有可行性，Myo-1和Egg抗原是最有前景的候选标志物，需在更大规模、更多样的人群以及包含非洲Paragonimus物种确诊病例中进行验证，以明确加蓬及周边地区的真实疾病负担。