布鲁氏菌效应蛋白BtpB通过靶向宿主蛋白YWHAZ调控细胞凋亡的机制研究

《Veterinary Research》：Effect of Brucella effector protein BtpB regulating apoptosis by targeting host protein YWHAZ

　　

布鲁氏菌是一种成功的胞内细菌，通过分泌多种毒力因子调控宿主细胞内的多种生理活动。然而，这些过程的具体分子机制仍不清楚。通过与宿主蛋白的相互作用，布鲁氏菌能够影响细胞生理过程，从而逃避免疫反应并增强细菌的生存和繁殖能力。布鲁氏菌的IV型分泌系统（type IV secretion system，T4SS）在布鲁氏菌感染细胞的过程中发挥重要作用。本研究通过分析112种与布鲁氏菌效应蛋白BtpB相互作用的宿主蛋白的相互作用网络，揭示了BtpB与YWHAZ（14–3-3ζ）之间的相互作用。此外，研究人员发现BtpB调控YWHAZ蛋白的表达，而其TIR结构域的缺失消除了这种相互作用以及对YWHAZ蛋白表达的影响。进一步地，BtpB激活促凋亡标志物，从而诱导细胞凋亡。研究结果提供了机制性证据，表明BtpB依赖的凋亡调控取决于其与YWHAZ的相互作用，并将YWHAZ进一步鉴定为控制布鲁氏菌胞内生存能力的宿主因子。该研究为宿主对胞内细菌感染的免疫应答机制提供了有价值的理解，并为未来布鲁氏菌病的预防和治疗策略提供了理论基础。

布鲁氏菌（Brucella）是一种兼性胞内寄生菌，可感染多种陆生和水生哺乳动物，引起布鲁氏菌病，表现为波状热、关节炎、心内膜炎等。尽管防控已开展一个多世纪，但人用疫苗仍未问世，且该菌被列为B类生物恐怖剂。布鲁氏菌通过IV型分泌系统（T4SS）分泌16种效应蛋白，其中含TIR结构域的BtpB可干扰Toll样受体信号、抑制树突细胞活化，但BtpB在宿主细胞内的靶蛋白以及对布鲁氏菌胞内生存的影响尚不清楚。细胞凋亡是宿主对抗细菌感染的常见应答，已有研究表明布鲁氏菌多种毒力因子可调控凋亡，但BtpB促进RAW264.7细胞凋亡的分子机制仍不明确。因此，阐明BtpB的宿主靶蛋白及其调控凋亡的机制，对理解布鲁氏菌致病机理和开发防治策略具有重要意义。

研究人员通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）相互作用组学筛选，鉴定出112个与BtpB互作的宿主蛋白，其中包含凋亡相关蛋白YWHAZ（14–3-3ζ）。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证了BtpB与YWHAZ的相互作用，并证明该作用依赖BtpB的TIR结构域。BtpB通过TIR结构域降低YWHAZ蛋白水平，且该降低并非转录抑制，而是经蛋白酶体和自噬-溶酶体途径降解。利用布鲁氏菌2308野生株与ΔbtpB缺失株感染HeLa和RAW264.7细胞，发现BtpB可促进促凋亡基因表达并诱导凋亡，缺失TIR结构域会削弱这一效应。YWHAZ过表达抑制布鲁氏菌胞内生存，沉默则增强其生存，且该效应与BtpB-YWHAZ相互作用相关。研究首次揭示BtpB靶向YWHAZ调控凋亡的机制，并鉴定YWHAZ为限制布鲁氏菌胞内生存的关键宿主因子，为布鲁氏菌病疫苗和治疗靶点开发提供了理论依据。

本研究的主要技术方法包括：使用布鲁氏菌流产种2308（Brucella abortus 2308）及其ΔbtpB突变株，人胚肾HEK-293T细胞、人宫颈癌HeLa细胞和小鼠巨噬细胞RAW264.7；采用LC-MS/MS进行BtpB互作宿主蛋白的相互作用组学分析；通过Co-IP和Western blot验证蛋白互作和表达水平；用qRT-PCR检测凋亡相关基因mRNA；流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率；应用蛋白酶体抑制剂MG132、自噬溶酶体抑制剂氯喹（CQ）和泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK确定降解途径；通过YWHAZ过表达和siRNA敲低评估其对布鲁氏菌胞内生存的影响。

结果部分：

**布鲁氏菌效应蛋白BtpB与YWHAZ相互作用的鉴定**
通过LC-MS/MS分析，研究人员鉴定出112个与BtpB互作的宿主蛋白，利用Proteome Discoverer 2.5进行网络分析，发现这些蛋白属于同一相互作用网络，其中YWHAZ为关键节点。Co-IP实验证实HA-BtpB与Flag-YWHAZ在HEK-293T细胞中共沉淀，而缺失TIR结构域的HA-BtpBΔTIR无法与YWHAZ互作，表明BtpB与YWHAZ的相互作用依赖TIR结构域。

**BtpB通过TIR结构域降低YWHAZ表达**
在HEK-293T细胞中梯度转染BtpB，Western blot显示外源和内源YWHAZ蛋白水平随BtpB表达增加而逐渐下降；而转染BtpBΔTIR对YWHAZ无显著影响。qRT-PCR显示YWHAZ mRNA水平无变化，说明非转录抑制。MG132和CQ处理可恢复BtpB引起的YWHAZ降低，而Z-VAD-FMK无效，表明BtpB通过蛋白酶体和自噬-溶酶体途径促进YWHAZ降解。

**布鲁氏菌2308 ΔbtpB缺失菌株抑制宿主细胞凋亡**
用布鲁氏菌2308和2308 ΔbtpB感染HeLa细胞，qRT-PCR和Western blot显示，与野生株相比，ΔbtpB株感染细胞中抗凋亡基因Bcl-2转录上调，促凋亡基因Bax、Caspase 3和AIF的转录及蛋白水平下调，在RAW264.7细胞中也得到一致结果，说明BtpB在布鲁氏菌感染中促进宿主细胞凋亡。

**BtpB通过TIR结构域影响凋亡相关基因的转录和蛋白表达**
在HeLa和RAW264.7细胞中单独转染BtpB或BtpBΔTIR，BtpB上调促凋亡基因Caspase 3、Bax和AIF的表达，BtpBΔTIR的增强效应减弱；共转染YWHAZ可部分逆转BtpB的促凋亡作用。流式细胞术显示BtpB转染细胞凋亡率随时间升高，BtpBΔTIR凋亡率低于BtpB，表明BtpB诱导凋亡依赖于TIR结构域及其与YWHAZ的相互作用。

**YWHAZ限制布鲁氏菌的胞内生存**
在HeLa和RAW264.7细胞中过表达YWHAZ，布鲁氏菌2308株的胞内生存显著受抑，而2308 ΔbtpB株所受抑制较弱；siRNA沉默YWHAZ则增强2308株的胞内生存，对ΔbtpB株影响较小。结果表明YWHAZ作为宿主限制因子控制布鲁氏菌胞内生存，且该作用与BtpB-YWHAZ相互作用密切相关。

讨论部分指出，BtpB和BtpA的TIR结构域具有NAD⁺水解酶活性，导致宿主NAD⁺耗尽。NAD⁺前体NMN可部分挽救BtpB诱导的凋亡，提示BtpB可能通过YWHAZ依赖和NAD⁺代谢依赖的双重途径促进凋亡。研究结论如下：总之，本研究聚焦于布鲁氏菌效应蛋白BtpB与宿主蛋白YWHAZ之间的相互作用，阐述了BtpB作用于YWHAZ的分子细节，证实了效应蛋白BtpB参与调控布鲁氏菌诱导的细胞凋亡，并研究了BtpB对凋亡途径的影响。研究证明BtpB对细胞凋亡的调控取决于其与YWHAZ的相互作用，并揭示了YWHAZ对布鲁氏菌胞内生存的影响。这些发现对理解布鲁氏菌的致病机制以及开发针对布鲁氏菌的新型疫苗和治疗靶点具有重要的科学意义。