重组GI-19型传染性支气管炎病毒诱导体液免疫抑制与法氏囊细胞凋亡及其对新城疫疫苗HI抗体应答的影响

《Veterinary Research》：Recombinant GI-19 infectious bronchitis virus induction of humoral immunosuppression with reduced HI antibody response following Newcastle disease virus vaccination and bursal cell apoptosis

　　

已有报道指出传染性支气管炎病毒（IBV）在法氏囊（BF）中的病理变化及病毒存在，但其免疫抑制作用仍未被充分阐明。本研究系统评估了两株GI-19谱系IBV分离株——CK/CH/FJ-B3/2023（法氏囊源）和CK/CH/FJ-T5/2023（气管源）——在7日龄无特定病原体（SPF）雏鸡中的致病性，并进一步检测了血清细胞因子及法氏囊细胞凋亡情况。研究人员还评估了这两株IBV分离株对新城疫病毒（NDV）灭活疫苗诱导的血凝抑制（HI）抗体应答的影响。研究表明，两株源自4/91疫苗株重组的GI-19谱系IBV分离株均表现出法氏囊嗜性，诱导法氏囊病理性萎缩、病毒持续检出至感染后35天（dpi），并将血清阳转延迟至14 dpi。值得注意的是，IBV感染在SPF鸡中诱导了体液免疫抑制，表现为在14和28 dpi时NDV-HI抗体滴度降低≥1log2，而抗体水平在35 dpi恢复至正常。这种免疫抑制伴随着持续的全身性促炎反应，其特征为感染雏鸡血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6和干扰素-γ（IFN-γ）持续上调至28 dpi。法氏囊早期细胞凋亡最早在1 dpi即可检测到，在整个观察期内，法氏囊凋亡指数显著高于阴性对照组。这些发现突显了IBV变异株诱导的体液免疫抑制。有必要进一步表征IBV类型，以阐明IBV的免疫抑制机制。

研究背景

传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus, IBV）是一种γ冠状病毒，自1936年首次发现以来，已成为商品家禽业中最普遍的呼吸道病原体之一。IBV主要在呼吸道复制，但也存在于肾脏、腺胃、输卵管、十二指肠、空肠、直肠等非呼吸组织，以及法氏囊（Bursa of Fabricius, BF）、脾脏、哈德氏腺（Harderian Gland, HG）和盲肠扁桃体（Cecal Tonsils, CT）等免疫器官。IBV在鸡群选择压力下通过频繁突变和重组事件快速进化，导致新基因型或变异株的出现。目前已分类的IBV基因型涵盖GI至GIX共38个病毒谱系，多数表现出多器官嗜性。

尽管IBV在免疫组织中的病毒持久性和病理变化已有报道，但其免疫抑制特性仍未得到充分表征。已知免疫抑制因子如传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV）和鸡贫血病毒（Chicken Anemia Virus, CAV）能在淋巴器官中快速复制并诱导细胞凋亡。IBV与这些免疫抑制剂的共感染会延缓免疫球蛋白A/免疫球蛋白G（IgA/IgG）的产生、阻碍生长并延长病毒持续期。然而，IBV单独感染是否会导致功能性损伤（如免疫细胞凋亡）以及对其他疫苗免疫应答的影响尚不清楚。此外，不同基因型的IBV诱导的促炎反应存在差异，但免疫组织中病毒的长期检出是否会引发持续性病理损伤和高水平细胞因子表达，最终导致免疫抑制，仍有待研究。

基于此，本研究从法氏囊和气管中分离了两株IBV毒株，旨在确定IBV感染是否诱导免疫抑制并损害新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）灭活疫苗血凝抑制（Hemagglutination Inhibition, HI）抗体的产生，通过结合临床症状、相对器官重量、组织病毒载量、细胞因子检测、IBV和NDV-HI抗体检测、组织病理学、法氏囊细胞凋亡及免疫组化检查进行了综合评估。

主要技术方法

研究人员于2023年5月从中国福建省的商品肉鸡群中分离获得两株IBV毒株（CK/CH/FJ-B3/2023和CK/CH/FJ-T5/2023），所有鸡只均已接种H120、793/B型和QX型活疫苗。病毒经10日龄无特定病原体（Specific Pathogen-Free, SPF）鸡胚盲传3-5代后分离纯化，并通过RT-PCR排除了H9亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）、滑液支原体（Mycoplasma synoviae, MS）、鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum, MG）、NDV、CAV、IBDV等多种病原污染。采用全基因组测序、S1基因系统发育分析和RDP4重组分析进行分子鉴定。致病性实验将120只7日龄SPF雏鸡随机分为阴性对照组和两个攻毒组（分别滴眼接种10^5.5 EID₅₀的T5或B3毒株），观察至35天，在不同时间点采集血液、泄殖腔拭子和组织样品。另设30只鸡用于NDV灭活疫苗免疫后的IBV攻毒实验（实验2）。采用IDEXX IBV抗体检测试剂盒测定血清IBV抗体，以4个HA单位的NDV抗原进行HI试验检测NDV特异性HI抗体。使用商品化ELISA试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）、白细胞介素1β（Interleukin 1β, IL-1β）、IL-6和干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）蛋白水平。采用RT-qPCR定量检测各组织的病毒载量。组织切片经苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色后进行组织病理学评分，使用抗IBV高免血清进行免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）检测病毒抗原，并通过TUNEL法分析法氏囊细胞凋亡指数（Apoptosis Index, AI）。

研究结果

S1基因系统发育分析：基于完整S1基因序列的系统发育分析显示，B3和T5毒株均聚类于GI-19谱系，与GI-19基因型的核苷酸序列相似性分别为94.69%-95.13%（B3）和95.19%-95.50%（T5）。

重组分析：重组分析揭示，B3和T5毒株均与4/91疫苗株（KF377577.1）发生了重组事件。B3毒株有两个重组断点（5'端核苷酸1-976和3'端核苷酸26996至基因组末端），T5毒株有一个3'端重组事件（核苷酸26950至基因组末端）。CK/CH/SX/2106（OQ189490.1）被确认为主要亲本毒株，4/91疫苗株为次要亲本贡献者。

临床体征：攻毒组雏鸡最早在3 dpi出现抑郁和呼吸道症状（喘息、咳嗽、摇头、气管啰音），呼吸道窘迫持续13天。B3攻毒组在21 dpi时采食量显著减少，28 dpi起出现腹泻并持续至35 dpi。

大体病变：剖检可见气管出血伴过量黏液（14和21 dpi时20%感染鸡只）。B3攻毒组在3 dpi即出现气囊炎并持续至28 dpi，T5攻毒组在7-21 dpi出现气囊炎，两组均在14 dpi达到高峰。感染组最早在3 dpi出现点状胸腺出血，21 dpi出现胸腺萎缩（T5和B3组分别为60%和80%）。法氏囊最早在3 dpi出现初始肿大，随后在28 dpi开始进行性萎缩，此时法氏囊大小与脾脏相当。

ELISA和NDV-HI抗体检测：感染鸡只在14或21 dpi首次检测到血清阳转，但即使在35 dpi，IBV抗体阳性率仍低于80%。实验2中，NDV-HI抗体滴度在攻毒组上升较慢。具体而言，在14 dpi时，G5（T5攻毒+NDV疫苗组）鸡只的NDV-HI滴度极显著低于G4（仅NDV疫苗组），降低了1.7-log₂；在28 dpi时，G6（B3攻毒+NDV疫苗组）鸡只的NDV-HI滴度高度显著低于G4，降低了1.5-log₂。

血清细胞因子表达：感染雏鸡血清中IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6在1 dpi即开始上调，并在整个实验期间维持高水平。B3攻毒组的四种细胞因子水平普遍高于T5攻毒组。与阴性对照组相比，B3组在多个时间点的细胞因子升高具有统计学显著性，而T5组仅在个别时间点显著升高。

相对器官重量：与阴性对照组相比，T5和B3攻毒组在14 dpi时体重显著下降，B3组在28和35 dpi时体重也显著下降。B3组在5 dpi时脾脏相对重量显著增加，但在35 dpi时显著减少。B3组法氏囊重量在35 dpi时显著下降，相对法氏囊重量在28和35 dpi时至少减少了0.13。

病毒载量：攻毒组泄殖腔拭子和法氏囊中病毒RNA可持续检出至35 dpi，而气管、胸腺和脾脏仅阳性至21 dpi。气管病毒载量在5 dpi达到峰值后迅速下降。B3攻毒组在5 dpi时泄殖腔拭子和法氏囊中的病毒载量极显著高于T5组。法氏囊、胸腺和脾脏中的病毒载量峰值出现在5或7 dpi。

组织病理学：感染组法氏囊出现多发性淋巴滤泡萎缩和耗竭、淋巴细胞浸润及衬里上皮鳞状化生。法氏囊组织病理学病变主要在14 dpi内发展，最早在1 dpi即可观察到（B3组）。B3组在5 dpi时所有鸡只均出现法氏囊病变，而T5组病变呈散发性。B3组在5 dpi时的法氏囊病理学评分显著高于阴性对照组和T5组。脾脏病变主要为轻度淋巴细胞浸润，两组间无显著差异。

免疫组化：在感染组的3 dpi，仅在气管和法氏囊中检测到IBV抗原阳性信号，免疫反应局限于上皮细胞，脾脏和胸腺中未观察到IBV抗原。

TUNEL分析：与阴性对照组相比，攻毒组在IBV感染后法氏囊凋亡指数（AI）显著增加。T5组在1、3、7和14 dpi时B淋巴细胞凋亡显著增多，B3组在1、5、7、14和28 dpi时凋亡水平显著升高。两组之间的AI无显著差异。

讨论与结论

本研究鉴定的两株GI-19谱系IBV毒株（法氏囊源B3和气管源T5）均与4/91疫苗株发生重组。两株毒株虽可在胸腺、脾脏和法氏囊中存在，但表现出法氏囊特异性嗜性和中央淋巴滤泡耗竭。7日龄SPF雏鸡感染后，法氏囊中出现病毒核酸长期检出和组织病理学萎缩，伴随细胞凋亡及促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6）水平升高，最终导致体液免疫抑制。

研究结论表明，两株源自4/91疫苗株重组的GI-19谱系IBV分离株均表现出法氏囊嗜性，诱导法氏囊病理性萎缩、病毒持续检出至35 dpi并将血清阳转延迟至14 dpi。IBV感染在SPF鸡中诱导了体液免疫抑制，表现为在14和28 dpi时NDV-HI抗体滴度降低≥1log₂，抗体水平在35 dpi恢复至正常。这种免疫抑制伴随着持续的全身性促炎反应，感染雏鸡血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ持续上调至28 dpi。法氏囊早期细胞凋亡最早在1 dpi即可检测到，在整个观察期内法氏囊凋亡指数显著高于阴性对照组。这些发现突显了IBV变异株诱导的体液免疫抑制，有必要进一步表征IBV类型以阐明其免疫抑制机制。