Epinecidin-1差异诱导骨肉瘤细胞肿瘤症与焦亡并增强甲氨蝶呤相关细胞毒性

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Epinecidin-1 Induces Distinct Oncosis and Pyroptosis Responses in Osteosarcoma Cells and Enhances Methotrexate-associated Cytotoxicity

　　

海洋抗菌肽epinecidin-1（epi）已知对多种癌症具有抑制作用。本研究进一步评估了epi在骨肉瘤中的治疗潜力。研究人员发现，epi可有效杀伤两种骨肉瘤细胞系MG63和U2OS。值得注意的是，这两种细胞系中的细胞毒性机制并非经典凋亡或坏死性凋亡（necroptosis），而是epi在U2OS细胞中诱导焦亡（pyroptosis），在MG63细胞中触发肿瘤症（oncosis）。在两种细胞系中，epi均引起线粒体损伤，并伴随细胞内钙的再分布，表现为线粒体钙减少和胞质钙增加。胞质钙增加进一步导致线粒体功能障碍和细胞死亡。此外，epi通过激活caspase-1刺激gasdermin D（GSDMD）裂解，从而引发焦亡。在MG63细胞中，胞质钙增加促进了epi诱导的肿瘤症。进一步地，epi与甲氨蝶呤（MTX）联用可增加细胞内MTX蓄积，并产生比任一单药处理更强的细胞毒性。研究人员还发现，epi抑制MG63来源的癌球，porimin表达增加提示肿瘤症的潜在参与。总体而言，本研究揭示epi对骨肉瘤癌细胞系和癌球具有强效细胞毒性作用，并增强MTX相关毒性。因此，本研究提示epi可通过不同机制抑制骨肉瘤，凸显其作为骨肉瘤治疗药物的前景。

骨肉瘤是最常见的骨癌类型，发病年龄呈双峰分布，主要影响青少年和50岁以上成人。若病灶局限，五年生存率约为70%，而一旦发生转移则低于30%。目前骨肉瘤的标准治疗是手术切除联合MAP方案化疗，即铂类药物、多柔比星和甲氨蝶呤（Methotrexate, MTX）联合使用。然而，约10%接受MAP化疗的患者会出现复发，转移患者接受MAP后的五年生存率不足20%。治疗失败的主要原因是肿瘤对MAP方案的内在性和获得性耐药，约34%–68%的耐药患者表现为内在耐药。因此，临床上迫切需要开发治疗骨肉瘤的新型药物。海洋抗菌肽epinecidin-1（epi）来源于点带石斑鱼（Epinephelus coioides），具有广谱杀菌、免疫调节和抗炎等活性，并且对正常细胞毒性较低。已有研究显示epi可抑制非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤和滑膜肉瘤，但其对骨肉瘤的抑制作用及毒性机制尚不清楚。既往研究多认为抗菌肽主要通过凋亡或坏死杀伤肿瘤细胞，而是否能够诱导肿瘤症（oncosis，一种以早期细胞肿胀、ATP耗竭、线粒体功能障碍和质膜破裂为特征的调节性细胞死亡）或焦亡（pyroptosis，一种依赖gasdermin家族打孔蛋白的裂解性细胞死亡）仍缺乏证据。基于此，研究人员系统评估了epi对骨肉瘤细胞系和癌球的抗肿瘤活性，并深入揭示了其诱导的细胞死亡类型及相关分子机制。研究结果证明，epi能通过焦亡和肿瘤症两种不同机制杀伤骨肉瘤细胞，抑制癌球形成，并增强MTX相关细胞毒性，提示epi有望成为治疗骨肉瘤的候选药物。

研究人员使用两种人骨肉瘤细胞系MG63和U2OS，细胞均购自台湾生物资源收集与研究中心（Bioresource Collection and Research Center）。关键技术方法包括：采用前向散射/侧向散射（FSC/SSC）、FITC annexin V/PI双染和结晶紫染色三种正交方法评估细胞死亡；利用流式细胞术检测线粒体膜电位（TMRE）、线粒体活性氧（MitoSOX Red）、线粒体钙（Rhod2-AM）、胞质钙（Fluo4-AM）、质膜电位（DiBAC4(3)）和细胞内ATP水平；借助扫描电镜与透射电镜观察细胞及线粒体超微结构；使用western blot检测cleaved GSDMD、catalase、UCP2和SOD2等蛋白表达；在超低附着培养板中培养MG63来源的癌球，并通过CD133、CD44和Oct4a染色鉴定癌球干细胞样特性；利用FITC标记的MTX检测药物蓄积，并采用Chou–Talalay法计算联合指数（CI）评价epi与MTX的药物相互作用。

在“Epi在骨肉瘤细胞中诱导细胞死亡”部分，研究人员用epi处理MG63和U2OS细胞24小时，发现epi可有效杀伤两种细胞。U2OS细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为18.18 μg/ml，而MG63细胞在测试浓度范围内未达到IC₅₀（>20 μg/ml），说明U2OS细胞对epi更敏感。由于MG63为p53缺失细胞，U2OS为野生型p53细胞，研究人员使用p53抑制剂pifithrin-α预处理U2OS细胞，发现epi诱导的细胞毒性显著减弱，提示p53参与epi对U2OS细胞的杀伤作用。此外，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1均不能抑制epi诱导的细胞死亡，说明epi并非通过凋亡或坏死性凋亡发挥毒性。

在“Epi在骨肉瘤细胞中诱导肿瘤症和焦亡”部分，光镜和扫描电镜显示epi处理后的细胞发生肿胀并出现气泡样突起；epi在5分钟内诱导质膜去极化，并降低细胞内ATP水平，这些特征符合肿瘤症和焦亡的共性表现。焦亡抑制剂VX-765可显著抑制epi在U2OS细胞中的细胞毒性，但对MG63细胞无保护作用。进一步实验显示，epi仅在U2OS细胞中增强caspase-1活性和GSDMD裂解，而p53抑制剂可减弱epi诱导的GSDMD活化，提示U2OS细胞发生焦亡。在MG63细胞中，epi显著增加肿瘤症相关标志物porimin的表达，提示MG63细胞发生肿瘤症。

在“Epi在骨肉瘤细胞中诱导线粒体损伤和氧化损伤”部分，epi降低两种细胞系的TMRE荧光强度，透射电镜显示线粒体嵴结构破坏和线粒体膜断裂。epi同时增加线粒体活性氧和氧化性DNA损伤标志物8-OHdG，并下调抗氧化蛋白catalase、UCP2和SOD2。线粒体活性氧清除剂MitoTEMPO可减轻epi在U2OS细胞中诱导的细胞死亡，但对MG63细胞无效。此外，VX-765不能抑制epi引起的线粒体损伤，提示cleaved GSDMD不参与epi诱导的线粒体功能障碍。

在“Epi改变钙亚细胞分布并增强MTX相关细胞毒性”部分，epi导致线粒体钙减少、胞质钙增加，提示细胞内钙发生再分布。钙螯合剂BAPTA可同时缓解epi诱导的线粒体损伤和细胞死亡，说明胞质钙升高是放大线粒体功能障碍和细胞死亡的重要共同环节。epi与MTX联合处理在两种细胞系中均产生比单药更强的细胞毒性和线粒体损伤。Chou–Talalay分析显示，两药相互作用呈细胞系和浓度依赖性：U2OS细胞中两个低浓度组合呈协同效应（CI=0.73、0.94），中浓度组合呈拮抗效应（CI=1.39）；MG63细胞中低至中浓度组合呈拮抗效应。进一步的FITC-MTX摄取实验显示，epi预处理可显著增加细胞内MTX蓄积，这可能是联合处理增强细胞毒性的原因之一。

在“Epi抑制癌球形成”部分，研究人员利用MG63细胞在超低附着培养板中形成癌球，并确认其表达干细胞标志物CD133、CD44和Oct4a。epi在细胞接种时加入可显著抑制癌球形成；对已形成的癌球，epi处理72小时后PI阳性细胞明显增加，annexin V/PI双染也证实epi诱导癌球细胞死亡。ZVAD、Nec-1和VX-765均不能抑制epi在癌球中的毒性，而epi可增加癌球细胞表面porimin表达，提示epi可能通过肿瘤症杀伤MG63来源的癌球。

讨论部分指出，epi在U2OS和MG63细胞中诱导不同死亡方式可能与其p53状态有关：U2OS为野生型p53，MG63为p53缺失，p53可经caspase-1和gasdermin家族蛋白参与焦亡调控；但研究未通过恢复MG63 p53表达直接验证因果关系。焦亡和肿瘤症均可释放损伤相关分子模式（DAMPs），可能增强抗肿瘤免疫。epi诱导的线粒体损伤并非由cleaved GSDMD介导，研究人员推测epi可能像其他抗菌肽那样直接靶向线粒体。胞质钙升高可能是epi诱导细胞死亡的共同上游事件，而下游通路决定焦亡或肿瘤症表型。epi与MTX联用增强细胞毒性，但协同与否取决于细胞类型和浓度；epi促进膜通透性并增加MTX蓄积，可能有助于克服化疗耐药。癌球对epi的敏感性高于贴壁细胞，15 μg/ml epi在MG63贴壁细胞中诱导约19%细胞死亡，而在MG63来源癌球细胞中诱导约96%细胞死亡，但其机制尚未阐明。

研究人员在结论部分总结：epi可在两种骨肉瘤细胞系中诱导不同的细胞死亡机制。在U2OS细胞中，epi诱导线粒体损伤并伴随胞质钙增加；胞质钙增加促进线粒体功能障碍和细胞死亡，同时caspase-1/GSDMD通路激活促进焦亡。在MG63细胞中，epi诱导线粒体损伤并伴随胞质钙增加，可能促成肿瘤症细胞死亡表型。与既往认为epi通过凋亡或坏死诱导癌细胞死亡的观点不同，本研究显示epi通过焦亡和肿瘤症两种不同机制触发骨肉瘤细胞死亡。此外，epi可抑制骨肉瘤细胞和癌球形成，诱导已形成癌球细胞死亡，并增强癌细胞中MTX相关细胞毒性。这些发现提示epi是治疗骨肉瘤的潜在候选药物。值得注意的是，本研究未评估epi对正常骨细胞的毒性，其安全性仍需在骨肉瘤类器官模型和体内研究中进一步验证。