《The Science of Nature》：Using next-generation sequencing to unravel the diet composition of Burrowing Parrots over the annual cycle
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了解生物的食性对于厘清其在生态系统功能中的角色、揭示觅食行为、种群动态、物种间竞争相互作用及进化过程至关重要。此外，食性研究有助于更好地解读环境变化及其对野生动物的影响。然而，研究在大范围区域觅食的生物的食性具有挑战性。在此类情况下，可通过对粪便样本中DNA进
了解生物的食性对于厘清其在生态系统功能中的角色、揭示觅食行为、种群动态、物种间竞争相互作用及进化过程至关重要。此外，食性研究有助于更好地解读环境变化及其对野生动物的影响。然而，研究在大范围区域觅食的生物的食性具有挑战性。在此类情况下，可通过对粪便样本中DNA进行下一代测序（next-generation sequencing, NGS）来鉴定所摄食的食物种类。研究人员采用该方法，对阿根廷巴塔哥尼亚东北部埃尔孔多（El Cóndor）种群的掘穴鹦哥（Cyanoliseus patagonus）的食性组成进行了研究。在年度周期内，研究人员在鸟类每晚使用的夜栖地收集粪便样本。全年在掘穴鹦哥食性中鉴定出大量植物分子可操作分类单元（molecular operational taxonomic units, MOTUs）。值得注意的是，所摄食的植物MOTUs中仅13%为本土植物。这一结果出乎意料，表明其食性已从过去以本土植物为主转变为当前以外来引入植物为主。这种转变可能体现了该物种在适应巴塔哥尼亚东北部当前严重环境退化过程中的行为灵活性；也可能是一种次优策略，可能对埃尔孔多种群（世界上最大的鹦形目Psittaciformes种群）的持续存在产生负面影响。此外，该方法还鉴定出此前未在掘穴鹦哥消化道记录到的寄生虫（柔线科Gongylonematidae、膜壳科Hymenolepididae、钩槽科Onchobothriidae和毛细科Capillariidae）。
了解生物的食性对揭示生态系统功能、觅食行为、种群动态、种间竞争和进化过程至关重要。然而，大范围觅食物种的食性研究难度较大；传统粪便镜检等方法存在侵入性强、分辨率低、时间尺度短等局限。近年来，粪便DNA宏条形码结合下一代测序（NGS）为非侵入性食性分析提供了有效途径。掘穴鹦哥（Cyanoliseus patagonus）是分布于阿根廷和智利的鹦形目（Psittaciformes）鸟类；位于阿根廷巴塔哥尼亚东北部埃尔孔多（El Cóndor）的群体是全世界最大的鹦形目繁殖群体，占全球繁殖种群的71%。该区域长期遭受“蒙特（Monte）”植被清除和城市化干扰，而此前对该物种食性的认识多来自零散记录，缺乏全年周期的系统研究。为此，研究人员利用粪便样本DNA宏条形码技术，对埃尔孔多掘穴鹦哥年度周期内的食性组成开展了研究。
研究人员于2021年1月至12月（2月除外）在埃尔孔多村夜栖地收集220份新鲜粪便样本，其中178份获得高质量DNA用于后续分析。采用靶向植物核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS2）和两侧对称动物（Bilateralia）的引物进行扩增PCR和加索引PCR，在Illumina MiSeq平台进行250 bp双端测序；通过FASTQC、TRIMMOMATIC、FLASH、MOTHUR、USEARCH等流程进行质控、拼接、去嵌合体和聚类，并以BLASTn比对NCBI GenBank数据库进行分子可操作分类单元（MOTU）注释。基于MOTU存在/缺失数据，使用非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling, NMDS）、置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）等比较各生活史阶段食性差异；同时开展参考数据库缺口分析和物候对应分析。
**食性组成**
共鉴定出202个有效植物MOTU（属于Spermatopsida），隶属23目48科；其中物种水平99个，属水平73个，科水平30个。繁殖期、繁殖后期、冬季和繁殖前期分别消费77、172、72和70个植物分类单元；繁殖后期食性多样性显著高于其他阶段（Kruskal-Wallis检验，χ
2=80.7，df=3，p<0.001）。Jaccard相似性系数为24.6%–31.0%。在所有MOTU中，外来植物占40%，推测外来占4.5%，观赏植物占12%，栽培植物占6.9%，本土植物仅占13%，其余24%无法确定。不同生活史阶段中，外来植物在多数样本中均有出现；栽培植物如燕麦（Avena sativa）、大麦（Hordeum vulgare）和小麦（Triticum sp.）在繁殖期、繁殖后期和冬季常见；本土植物如Festuca sp.、Condalia sp.等则在繁殖后期出现较多。物种和属水平上，繁殖期、繁殖后期和繁殖前期之间重叠较大，冬季与其他阶段重叠较小；科水平上，繁殖后期与其他阶段重叠较小。
**缺口分析**
对埃尔孔多周边区域本土植物在NCBI GenBank参考库中的代表性进行了评估。物种水平上，69%的本土植物有参考序列；属水平上，97%有参考序列。参考序列缺口较大的类群包括菊科（Asteraceae）、仙人掌科（Cactaceae）、凤梨科（Bromeliaceae）和豆科（Fabaceae）。参考库在属水平上覆盖较充分，不足以完全解释外来植物高比例的现象。
**检出的Bilateralia**
利用Bilateralia引物鉴定出31个有效MOTU，隶属9纲18目25科。其中可归为肠道寄生虫的有膜壳科（Hymenolepididae）、钩槽科（Onchobothriidae）和毛细科（Capillariidae），口腔寄生虫为柔线科（Gongylonematidae），另有臭虫科（Cimicidae）等外寄生虫及可能随食物或水误食的类群。
研究者指出，绝大多数样本在各阶段均含外来植物，而本土植物仅少数样本检出，这与过去认为蒙特/埃斯皮纳尔（Espinal）本土植物为其主要食源的认识明显不同。通过方法偏差、参考序列缺口和生境退化等分析，研究者认为参考库缺口不足以完全解释该结果；而研究区域内长期高强度清除自然植被、农业扩张和外来植物扩散是更符合现实的解释。此外，研究期间及之前持续的拉尼娜（La Ni?a）事件可能降低本土植物生产力，但单年采样无法推断因果关系。栽培植物检出与当地牧草种植面积数据一致，支持掘穴鹦哥主要取食收割散落谷粒和栽培牧草的观点。寄生虫方面，柔线虫科感染可能与此前观察到的2020–2021年繁殖季成鸟大量死亡事件有关，但需进一步研究。
研究人员认为，粪便DNA下一代测序使揭示埃尔孔多掘穴鹦哥的年度食性成为可能。结果显示其食性已由过去以蒙特/埃斯皮纳尔本土植物为主转变为当前以外来植物为主。这一转变可能体现其行为灵活性，也可能是影响埃尔孔多群体持续存在的次优策略。鉴于蒙特植被清除仍在继续，且该群体占全球繁殖对的71%，亟需持续监测种群规模和食性以制定保护措施；同时，柔线科寄生虫与2020–2021年死亡的潜在关联值得进一步研究。
