内皮Epac1通过调控VEGFR2与YAP/TAZ信号驱动黑色素瘤血管生成

《Angiogenesis》：Endothelial Epac1 facilitates YAP/TAZ controlled melanoma growth and angiogenesis

　　

RapGEF（Rap鸟苷酸交换因子）Epac1已成为促血管生成信号通路（包括VEGF（血管内皮生长因子）/VEGFR2（血管内皮生长因子受体2））的重要调节因子。然而其在肿瘤血管生成中的具体作用此前未被阐明。研究人员发现内皮Epac1是黑色素瘤血管生成的关键驱动因子。对患者来源黑色素瘤的分析显示，Epac1在肿瘤内皮细胞中显著上调。研究人员利用全局性及内皮特异性Epac1敲除小鼠模型证明，皮下接种黑色素瘤细胞后，Epac1缺失可降低黑色素瘤生长与血管化。对Epac1缺陷小鼠肿瘤相关内皮细胞的转录组分析显示，促血管生成基因及YAP/TAZ靶基因广泛下调。体外Epac1敲除内皮细胞系中，VEGFR2表达、YAP/TAZ核转位及YAP/TAZ靶基因转录均受抑。一致地，Epac1缺失削弱VE-cadherin（血管内皮钙黏蛋白）/VEGFR2相互作用、VEGF依赖的YAP/TAZ入核及转录活性，并消除内皮细胞对剪切力的排列反应。结果表明Epac1是VEGFR2与YAP/TAZ信号的中枢调节因子，在黑色素瘤血管化过程中整合血管生成与机械感受信号。

研究背景方面，血管生成与血管重塑受内皮细胞迁移、增殖及基质与机械信号共同调控。病理状态下，肿瘤血管生成失调，VEGF/VEGFR2是公认的肿瘤血管生成驱动通路；cAMP效应分子Epac（exchange protein directly activated by cAMP，cAMP直接激活交换蛋白）中，仅Epac1在 endothelial cell（EC，内皮细胞）表达，并参与连接动力学与极性调节，但其内皮Epac1在肿瘤微环境血管生成中的病理功能尚不清楚。已有研究提示Epac1可促进VEGF/VEGFR2相关血管生成，而YAP/TAZ作为机械敏感Hippo通路效应分子可整合胞外信号与细胞骨架动态调节内皮功能，并在肿瘤内皮中被激活。因此，研究人员假设内皮Epac1在肿瘤血管化中具有关键作用，并开展本研究，论文发表于《Angiogenesis》。

主要关键技术方法上，研究人员使用患者来源人原代黑色素瘤与正常人皮肤单细泡RNA测序（scRNA-seq）队列、小鼠B16F10皮下黑色素瘤模型、全局性与Cdh5-Cre^ERT2诱导型内皮特异性Epac1敲除小鼠、肿瘤内皮细胞（TEC）与脑内皮细胞磁珠分选、CRISPR/Cas9构建Epac1敲除bEnd.3内皮细胞、HUVEC原代内皮细胞及CE3F4抑制Epac1 GEF活性、RNA测序与GO分析、YAP/TAZ核定位免疫荧光、TEAD荧光素酶报告、RhoA-GTP pulldown、体外血管出芽与流致剪切力实验。

研究结果如下。Global loss of Epac1 leads to a reduction in subcutaneous melanoma tumor volume and to impaired melanoma angiogenesis：研究人员通过全局Epac1敲除小鼠接种B16F10细胞，发现第14天后肿瘤生长明显受限，CD31阳性血管面积与CD31蛋白下降，说明全局Epac1缺失损害黑色素瘤血管化；人scRNA-seq中RAPGEF3（EPAC1）在黑色素瘤血管内皮中富集。

Epac1 expression is increased in human melanoma endothelial cells：整合健康皮肤与原发性黑色素瘤scRNA-seq内皮群，研究人员确认RAPGEF3在黑色素瘤来源EC中较健康皮肤EC显著升高，提示肿瘤内皮Epac1上调。

Endothelial Epac1 is required for melanoma vascularization：以内皮特异性Epac1^iΔEC小鼠进行皮下黑色素瘤建模，TEC中Epac1 mRNA约敲除50%，肿瘤体积与CD31血管面积均显著减少，证明内皮Epac1直接促进黑色素瘤血管化与生长。

Endothelial Epac1 deletion suppresses angiogenesis-related genes：对TEC做转录组，GO显示出芽血管生成、EC迁移与增殖通路下调；Kdr（Vegfr2）、Angpt1、Hif1a、Dll1/4及YAP/TAZ-TEAD靶Ccn1、Ccn2、Ankrd1下调，瘤内VEGFR2蛋白与Ccn2 smFISH信号降低，表明内皮Epac1缺失抑制促血管生成及YAP/TAZ相关转录程序。

Endothelial Epac1 regulates transcriptional activity of YAP/TAZ in vitro：CRISPR敲除bEnd.3与TEC共享下调基因富集于血管生成、增殖、迁移；YAP/TAZ蛋白量不变而CCN2下降；HUVEC用CE3F4抑制Epac1 GEF活性后YAP/TAZ靶基因CCN1、CCN2、ANKRD1降低，证实现Epac1酶活维持YAP/TAZ依赖转录。

Epac1 regulates YAP/TAZ nuclear localization：免疫染色显示Epac1 KO细胞中核YAP/TAZ减少；HOPFlash/HIPFlash报告实验表明TEAD依赖转录活性下降，HUVEC中CE3F4同样减少YAP/TAZ入核，说明Epac1调控YAP/TAZ亚细胞定位与转录。

Epac1 coordinates VEGF/VEGFR2-mediated activation of YAP/TAZ signalling through RhoA-dependent regulation of the actin cytoskeleton：VEGF在对照组诱导Vegfr2、Ccn2及出芽，Epac1缺失后基底与VEGF诱导反应消失；VEGFR2抑制剂anlotinib阻断该表型。机制上VEGF引起对照细胞RhoA活化及MLC2 Ser¹⁹磷酸化，Epac1 KO中受损；C3转移酶抑制RhoA降低TEAD报告与Ccn2表达，表明Epac1经RhoA/肌动蛋白细胞骨架耦合VEGF/VEGFR2与YAP/TAZ。

讨论与结论部分总结：研究人员指出，内皮Epac1是黑色素瘤血管生成的关键驱动因子，可上调并维持VEGFR2表达、VE-cadherin/VEGFR2复合、VEGF依赖的YAP/TAZ核转位与TEAD转录，并经RhoA-MLC2细胞骨架轴整合血流剪切等机械信号。结论可译为：研究人员揭示内皮Epac1是VEGFR2与YAP/TAZ信号的中枢调节因子，在黑色素瘤血管化过程中整合血管生成与机械感受线索；靶向内皮Epac1或其GEF活性可抑制肿瘤内皮YAP/TAZ转录程序与病理性血管生成，为抗肿瘤血管生成治疗提供内皮特异性干预思路。