《Annals of Surgical Oncology》：Molecular HPV Detection in Sentinel Lymph Nodes Using Next Generation Sequencing: Concordance with Ultrastaging and Biological Relevance in Early-Stage Cervical Cancer
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背景：前哨淋巴结（sentinel lymph node, SLN）超分期（ultrastaging，一种通过连续切片和免疫组化提高隐匿性转移检出率的病理检查方法）是早期宫颈癌淋巴结评估的标准方法，但受限于取样范围和工作量。人乳头瘤病毒（human papil
背景：前哨淋巴结（sentinel lymph node, SLN）超分期（ultrastaging，一种通过连续切片和免疫组化提高隐匿性转移检出率的病理检查方法）是早期宫颈癌淋巴结评估的标准方法，但受限于取样范围和工作量。人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）的分子检测可能识别转移性疾病。本研究评估了基于下一代测序（next generation sequencing, NGS）的SLN HPV检测作为SLN评估补充方法的可行性。
患者与方法：这项前瞻性队列研究纳入了122例接受初次手术和SLN示踪的早期宫颈癌女性。SLN通过超分期和基于NGS的HPV基因分型panel进行检测。部分患者额外接受了基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）的HPV分析。
结果：共有17例患者（13.9%）通过超分期发现SLN转移，所有患者NGS检测均为HPV阳性。HPV读段数与SLN转移大小相关（Spearman’s ρ = 0.73，p < 0.001）。NGS额外在13例（10.7%）超分期阴性的患者中检出HPV。与两种方法均阴性的患者相比，这些患者肿瘤体积显著更大（p = 0.009），国际妇产科联盟（International Federation of Obstetrics and Gynecology, FIGO）分期更高（p = 0.02），同时其HPV读段数显著低于超分期和NGS均阳性的患者（p = 0.03）。PCR检出的HPV阳性SLN数量多于NGS。
结论：NGS在所有超分期证实的SLN转移中均检出HPV，并识别出一个额外的超声期阴性但分子HPV检测阳性的患者亚组。HPV数量与转移大小及不良临床病理特征之间的关联支持SLN中定量HPV检测的生物学意义。这些发现支持在更大规模前瞻性研究中进一步评估NGS作为SLN评估补充分子生物标志物的价值。
早期宫颈癌的标准淋巴结评估依赖于前哨淋巴结（sentinel lymph node, SLN）的超分期（ultrastaging，通过连续切片和免疫组化检测隐匿性转移）。然而，超分期仅检查有限比例的淋巴结组织、工作量大且缺乏统一方案。即使超分期阴性，仍有8%–15%的患者出现复发，提示存在常规病理学方法无法检出的肿瘤播散。人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是宫颈癌的必要驱动因素，原发肿瘤与转移灶中HPV基因型高度一致，因此SLN中的HPV DNA或mRNA检测是生物学上合理的肿瘤播散标志物。既往聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测HPV灵敏度高，但多为定性，且检出率显著高于组织学转移率，其临床意义不明确。数字液滴PCR（digital droplet PCR, ddPCR）可定量但仅针对预设基因型。下一代测序（next generation sequencing, NGS）能在单一检测中同时鉴定多种HPV基因型并提供半定量信息，且成本已显著下降。然而，尚无研究评估NGS在宫颈癌SLN中检测HPV的价值。因此，本研究旨在评估基于NGS的SLN HPV检测作为补充性分子方法的价值。
研究人员开展了一项前瞻性队列研究，纳入122例接受初次手术和SLN示踪的早期宫颈癌患者（FIGO 2018 IA1–IIA1期），来自丹麦Aarhus和Odense大学医院。所有原发肿瘤和SLN均进行NGS HPV检测，并在30例亚组中额外进行PCR检测。研究得出以下结论：NGS检出了所有超分期确认的SLN转移，并额外识别出超分期阴性但NGS阳性的患者，这些患者具有更大的肿瘤体积和更高的FIGO分期。HPV测序读段数与转移大小显著相关，提示HPV定量可反映肿瘤负荷。该研究首次证明了NGS作为SLN评估补充方法的可行性和生物学合理性，为未来改进淋巴结分子分期提供了基础。
主要技术方法：本研究为前瞻性队列研究，样本来源于丹麦Aarhus和Odense大学医院2018年10月至2023年11月收治的122例早期宫颈癌患者。SLN按丹麦国家超分期方案处理，以2 mm间隔切片，每个组织块在350 μm间隔的四个水平切片，每层行H&E和细胞角蛋白AE1/AE3染色，并另取未染色切片。本研究中，每个水平额外取两张5 μm切片，将同一淋巴结切片混合后提取DNA，同时收集原发肿瘤及转移性非SLN组织。NGS采用内部开发的HPV分型panel，靶向27种HPV基因型（包括25种高危/可能高危型和低危型HPV6、HPV11），每个基因型扩增8个区域，另含5个人类参考基因，测序平台为Ion GeneStudio S5。HPV阳性阈值事先设定：同一HPV基因型至少两个扩增子的测序读段数>20；对于淋巴结，还要求HPV基因型与原发肿瘤一致。在30例亚组中，使用INNO-LiPA试剂盒进行PCR检测。统计方法包括卡方检验、Fisher精确检验、Mann-Whitney U检验和Spearman相关分析。
**患者特征与分组**：122例患者中，75例（61.5%）为鳞状细胞癌，34.4%为腺癌，4.1%为腺鳞癌。22例（18.0%）最终分期为FIGO 2018 IIIC1或IIIC2，9例（7.4%）出现复发。根据超分期和NGS结果将患者分为四组，没有患者为超分期阳性/NGS阴性（0.0%，95%置信区间0.0–3.0%）。
**NGS检测原发肿瘤和SLN中的HPV**：所有原发肿瘤均为高危HPV阳性，HPV16最常见（44.3%），其次为HPV18（23.8%）、HPV33（5.7%）和HPV45（5.7%）。NGS在17例超分期阳性患者中全部检出HPV，并在13例（10.7%）超分期阴性患者中检出HPV，共30例（24.6%）NGS阳性。在92例两者均阴性者中，45例（48.9%）有≤1个测序读段，43例（46.7%）低于阈值，4例（4.3%）读段超过阈值但基因型与原发肿瘤不一致。对最近61例患者，仅用浅表层面（level 1）切片检测，9例超分期阳性者中仅7例检出HPV，说明浅表取样不能替代四水平混合分析。
**按SLN HPV状态分类的临床病理特征**：超分期阴性/NGS阳性患者相比两者均阴性者，原发肿瘤更大（p = 0.009），FIGO分期更高（p = 0.02），淋巴血管间隙浸润（lymphovascular space invasion, LVSI）无显著差异（p = 0.57）。
**转移大小与HPV NGS读段数的关联**：在超分期阳性/NGS阳性组中，HPV读段数与SLN转移大小呈强相关（Spearman’s ρ = 0.73，p < 0.001）。典型示例显示，宏转移（>2 mm）SLN的HPV读段数（中位数668）显著高于微转移（≤2 mm）SLN（中位数102）。
**NGS阳性SLN中按超分期状态比较HPV数量**：超分期阳性/NGS阳性组的中位HPV读段数显著高于超分期阴性/NGS阳性组（92.8对27.2，p = 0.03），表明超分期阳性SLN中肿瘤源性病毒DNA负荷更高。
**非SLN转移**：5例患者有组织学确认的非SLN转移，其中2例对应SLN也NGS阳性，另外3例仅在转移性非SLN中检出HPV。
**PCR和NGS检测SLN中的HPV**：在30例亚组中，超分期确认6例（20%）SLN转移；NGS检出8例（27%）HPV阳性，INNO-LiPA检出15例（50%）HPV阳性。两种方法均检出所有6例超分期阳性SLN。在超分期阴性者中，NGS检出2例（8.3%），INNO-LiPA检出9例（37.5%）阳性，显示PCR检出率显著更高。
讨论部分指出，NGS检出了所有超分期确认的SLN转移，与既往基于PCR或mRNA的研究一致。超分期阴性/NGS阳性患者具有更大的肿瘤和更高的FIGO分期，支持这些分子发现的生物学意义。定量关系表明HPV读段数反映淋巴结内肿瘤源性病毒DNA数量，可能提供超越二元阳性的信息。PCR检出率更高，但无法确定额外检出的HPV是否具有临床相关性。目前结果不建议改变临床实践，超分期仍是SLN评估的标准方法。局限性包括样本量小、复发事件少、随访时间相对较短（中位56.8个月）、未检测HPV转录活性。未来需更大规模前瞻性研究，整合定量HPV、病毒转录活性和长期预后数据。
研究结论：NGS检出了所有超分期确认的SLN转移，并识别出一个额外的超分期阴性但具有不良临床病理特征的患者亚组。HPV读段数与SLN转移大小相关，支持基于NGS的HPV检测作为SLN评估补充方法的可行性和生物学合理性。需要进一步研究来确定组织学阴性SLN中分子HPV检测的临床意义。
