《Cancer and Metastasis Reviews》：Extracellular vesicles in breast cancer metastasis: functional insights and advances in single-EV analysis
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摘要专业翻译：
尽管筛查与诊断技术取得了显著进步，乳腺癌（BC）转移仍是导致患者死亡的首要原因。细胞外囊泡（EVs）由所有活细胞分泌，携带RNA和蛋白质等具有生物活性的货物，在细胞间通讯中发挥关键作用。不同的EV亚群参与塑造肿瘤微环境（TME）、促进转移前微环
摘要专业翻译：
尽管筛查与诊断技术取得了显著进步，乳腺癌（BC）转移仍是导致患者死亡的首要原因。细胞外囊泡（EVs）由所有活细胞分泌，携带RNA和蛋白质等具有生物活性的货物，在细胞间通讯中发挥关键作用。不同的EV亚群参与塑造肿瘤微环境（TME）、促进转移前微环境（PMN）形成、介导免疫逃逸、重塑细胞外基质（ECM），并最终促进乳腺癌的器官向性（organotropism）转移。除生物学功能外，越来越多的证据表明EVs可作为潜在的诊断和预后生物标志物，同时也是可行的治疗靶点。然而，EVs在乳腺癌转移中的全部功能范围仍不清楚，其固有的异质性和分子复杂性对临床转化构成了重大障碍。应对这些挑战，既需要清晰理解每个EV亚群的独特功能，也需要应用先进的单囊泡（single-EV）分析技术。在本综述中，研究人员全面审视了EV亚群对乳腺癌转移的功能贡献，并对所讨论的每种RNA和蛋白质货物赋予了分级证据等级。研究人员进一步探讨了EV脂质、非囊泡性细胞外颗粒（non-vesicular extracellular particles）以及当前靶向EV的治疗策略。最后，研究人员强调单囊泡分析是解决上述复杂性并将EV生物学转化为临床可应用的生物标志物和治疗靶点的有前景策略。
论文主体内容专业总结
1 引言
乳腺癌（BC）的临床病程呈现一个悖论：虽然局部病变的治疗显著提高了生存率，但远处转移的进展仍是重大临床挑战。约20–30%的早期BC患者在初次治疗后10年内发生远处转移，转移相关死亡占BC相关死亡的近90%。癌症转移涉及序贯阶段，包括癌细胞从原发肿瘤脱离和扩散、进入血液或淋巴系统、外渗至远处器官并在新环境中增殖。然而，单一BC细胞群体在转移研究中表现出因遗传变异及与其他细胞或细胞外基质（ECM）相互作用导致的表型异质性。因此，研究焦点转向肿瘤微环境（TME）。在此环境中，细胞释放的细胞外囊泡（EVs）近年受到广泛关注，影响癌症的多项标志性特征。在BC中，不同EV亚群——主要为小细胞外囊泡（sEVs）、大细胞外囊泡（lEVs）和凋亡小体——在促进肿瘤进展和转移中发挥不同作用。EVs是脂质双层囊泡，携带蛋白质、脂质、DNA和RNA，通过运输生物活性货物介导细胞间通讯。依据MISEV指南，sEVs直径约50–200 nm，lEVs为150–500 nm，凋亡小体为500–4000 nm。由于EV尺寸范围重叠且常用分离方法也可能回收非囊泡性细胞外颗粒（如exomeres和supermeres），研究人员不将sEV和lEV分别与exosome和microvesicle等同使用。尽管研究投入巨大，EVs的临床转化仍具挑战性，肿瘤药物开发I期临床试验成功率仅约3.4%。本综述首次系统性地对BC转移中EV货物应用证据分级，并重点介绍新兴的单囊泡分析技术，如纳米流式细胞术、液滴法、拉曼光谱法、适配体检测和基于显微镜的单囊泡成像，以解析囊泡异质性并识别传统批量研究中可能被掩盖的转移特异性EV亚群。
2 EV亚群在BC转移中的功能
EVs通过肿瘤细胞与基质细胞间的相互作用介导BC微环境中的细胞间通讯。EVs保护RNA货物免受细胞外环境降解，其促转移功能由包括蛋白质和核酸在内的多样化货物驱动。微小RNA（miRNAs）通过结合靶mRNA抑制其翻译；长链非编码RNA（lncRNAs）通过“海绵吸附”miRNAs的竞争性内源RNA（ceRNA）机制调控基因表达；环状RNA（circRNAs）因共价闭合环结构而高度稳定，常富集于包括外泌体和微囊泡在内的细胞外囊泡中。此外，BC细胞系来源sEV的蛋白质组学分析已鉴定出多种转移相关蛋白，包括Ezrin、膜联蛋白A5、膜联蛋白A6、腱生蛋白及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN/CD147）。
2.1 sEV RNAs在BC转移中的功能
常见BC sEV RNAs通过多种汇聚机制促进转移，包括增加内皮通透性、诱导上皮-间质转化（EMT）、免疫调节和转移前微环境（PMN）形成。BC来源的sEV非编码RNA（ncRNAs）可将巨噬细胞重编程为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型，创造免疫抑制微环境。例如，sEV miR-33、miR-130和circ-0100519促进巨噬细胞活化为TAMs；sEV circ-0100519通过USP7介导的去泛素化稳定NRF2，诱导TAM样表型；sEV miR-138-5p通过抑制KDM6B促进TAM样极化，从而促进三阴性乳腺癌（TNBC）肺转移；RAB5A增强sEV miR-21向巨噬细胞的转移，抑制PELI1并促进TAM样极化；sEV miR-21还通过抑制破骨前体细胞中的PDCD4促进BC破骨细胞生成，支持骨转移微环境形成。在内质网应激条件下，sEV miR-27a-3p抑制巨噬细胞中MAGI2，削弱PTEN介导的PI3K/AKT信号抑制，导致PD-L1表达增加，减少细胞因子分泌并促进T细胞凋亡，实现免疫逃逸。sEV circ-EGFR通过促进TFEB核转位和调节miR-224-5p/ATG13/ULK1反馈环促进TNBC细胞自噬；sEV circ-PSMA1通过海绵吸附miR-637激活AKT1/β-catenin信号，促进免疫抑制和TNBC转移。sEV RNAs还介导肿瘤细胞与成纤维细胞间的双向通讯：TNBC来源的sEV miR-125b和miR-370-3p促进成纤维细胞分化为癌症相关成纤维细胞（CAFs）；CAF来源的sEV miR-500a-5p和miR-18b通过下调USP28和TCEAL7增强BC细胞转移特征。在血管重塑方面，高转移TNBC细胞分泌的sEV miR-105抑制紧密连接蛋白ZO-1，破坏内皮屏障，增加血管通透性。在转移级联中，sEV miR-10b通过抑制HOXD10促进受体细胞侵袭行为；sEV miR-222通过抑制PDLIM2维持NF-κB信号通路；lncRNA NEAT1通过海绵吸附miR-141-3p上调KLF12；sEV MALAT1通过抑制miR-1-3p促进VASP表达。sEV miR-7641在转移性BC细胞系和远处转移患者血浆中显著升高；sEV miR-361-3p靶向ETV7和BATF2，上调PAI-1并激活ERK信号。在器官特异性转移方面，sEV miR-200促进肺转移定植；sEV miR-4443抑制TIMP2并上调MMPs促进肝转移；脑转移BC细胞分泌高水平的sEV miR-1246和miR-1290激活脑转移微环境中的星形胶质细胞，sEV miR-301a-3p和lncRNA GS1-600G8.5破坏血脑屏障，星形胶质细胞也可通过sEV传递miR-19a下调PTEN促进脑转移，sEV miR-199b-5p通过抑制溶质载体转运体干扰神经元代谢偶联促进脑转移生长；骨转移TNBC来源的sEV miR-940促进间充质干细胞成骨分化，sEV miR-19a和IBSP协同诱导溶骨性骨转移，sEV miR-218通过下调I型胶原沉积调节骨基质。需注意，由于miRNA在供体细胞中的过表达会增加其在条件培养基整体的丰度而非仅囊泡内，所观察到的表型可能归因于非EV载体，因此表1中的RNA货物被视为具有稳健的BC转移介导意义，其囊泡递送虽合理但多数情况下未经正式证实。
2.2 sEV蛋白在BC转移中的功能
sEV蛋白通过促进侵袭、血管生成、免疫逃逸和PMN形成参与BC转移。在TNBC中，整合素αvβ1与CD63在sEV内共定位，该复合物帮助sEV结合纤连蛋白，增加成纤维细胞摄取；摄取后sEV Survivin上调SOD1表达，促进CAF样表型形成。ER?PR? BC细胞释放含功能获得性突变p53蛋白的sEVs，与HSP90结合并转移至成纤维细胞，激活CAFs。TNBC来源sEV中SIPA1高表达，与巨噬细胞浸润和迁移增加相关。BC患者血浆来源sEV高表达PD-L1，直接结合T细胞上的PD-1抑制其活性；sEV PD-L1在TAMs中比BC细胞更丰富，促进M2样巨噬细胞极化。USP8通过去泛素化TGF-β受体TβRII增加其装载入sEVs，转移至CD8? T细胞后激活SMAD3，促进T细胞耗竭表型。sEV相关ICAM1与CD8? T细胞耗竭、TNBC肿瘤生长和骨转移相关。TNBC来源sEV中富集的血小板反应蛋白-1（TSP1）下调血管内皮钙黏蛋白和ZO-1，削弱血管屏障；含核苷二磷酸激酶（NDPK）的TNBC来源sEVs也增加血管通透性。L-plastin和EDIL3与TNBC细胞黏附、侵袭和转移相关。sEV整合素β1的平分型GlcNAc修饰水平降低可增加其促转移活性。TNBC来源sEV携带的EPHA2通过破坏内皮屏障增加血管通透性，并通过激活AMPK信号促进血管生成。高转移TNBC细胞系来源sEV中MMP-1高表达，通过激活PAR1介导EMT促进转移。在器官向性方面，BC来源sEV的特定整合素介导器官特异性相互作用，激活Src磷酸化并诱导促炎基因表达；sEV TGFβ1增加肝内皮细胞纤连蛋白表达，促进肝转移微环境建立；sEV Caveolin-1调节整合素α6β4和TLR4信号，促进细胞因子释放、TAM激活和血管生成，参与肺转移前的炎症启动；脑转移BC细胞来源EVs可能通过转cytosis穿越血脑屏障，涉及Rab11fip3和Rab11fip5上调；sEV CEMIP在脑转移BC细胞中选择性上调，通过增强血管重塑相关炎症细胞因子表达支持脑转移微环境形成。
2.3 lEV在BC转移中的功能
lEVs通过向受体细胞转移蛋白质、脂质、DNA和RNA等生物活性分子促进BC肿瘤进展和转移，尽管研究程度低于sEVs，但新证据表明lEVs是转移级联的关键介质。lEVs可通过免疫和非免疫机制促进转移。TNBC患者来源的PD-L1阳性lEVs抑制细胞毒性T细胞活性，并通过激活TBK1/STAT6通路促进巨噬细胞M2样极化和免疫抑制微环境形成。放疗诱导释放含PD-L1的lEVs，部分以PD-L1依赖性方式抑制细胞毒性T细胞活性。高转移或化疗暴露BC细胞来源的lEVs通过CD44介导减少黏着斑并诱导肌动蛋白细胞骨架重排，增强低转移BC细胞的转移潜能。lEVs还重塑肿瘤微环境的非恶性成分：弱迁移性转移BC细胞释放的富含转谷氨酰胺酶2（Tg2）的lEVs激活成纤维细胞并增加肿瘤硬度，导致肿瘤细胞播散。在TNBC中，新辅助化疗增加暴露磷脂酰丝氨酸的lEVs释放，促进血小板活化和凝血、增加内皮通透性并促进肿瘤细胞跨内皮迁移。比较蛋白质组学分析显示，TNBC细胞中lEVs和sEVs含有大量重叠蛋白，但包括功能性代谢酶在内的若干蛋白在lEVs中特异性富集，且蛋白谱因EV亚群和BC细胞系而异。在脂质组成方面，脂肪细胞来源sEVs富集胆固醇，而lEVs含有更高水平的外化磷脂酰丝氨酸；EV膜上的磷脂酰丝氨酸可能促进巨噬细胞识别和摄取。亚型特异性脂质谱可能在BC进展中发挥重要作用，并为BC检测和分类提供额外生物标志物。
