实验性胶质母细胞瘤中血脑屏障破坏对TSPO-PET信号在细胞与细胞外区室分配的影响

《European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging》：Allocation of TSPO-PET signals to cellular and extracellular compartments in dependence of blood-brain barrier disruption in experimental glioblastoma

　　

转位蛋白（translocator protein, TSPO）-正电子发射断层扫描（PET）成像有助于临床前模型和患者中胶质母细胞瘤的监测。然而，TSPO-PET信号的特异性仍有待研究。本研究旨在解析实验性胶质母细胞瘤小鼠模型中细胞和细胞外区室的精确贡献，包括血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏的影响。研究人员将植入胶质母细胞瘤（SB28；早期n=36，晚期n=39；GFP(+)）的小鼠注射TSPO示踪剂[¹⁸F]GE-180（21 MBq±1.5 MBq）。在过量冷示踪剂预先阻断与否的条件下进行60 min动态microPET扫描。将肿瘤解离，随后对肿瘤细胞、肿瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞（TAMs, CD11b(+)）和非肿瘤/非TAM（即剩余）细胞进行细胞分选，并进行γ射线测量和流式细胞术（scRadiotracing），以计算单个细胞的放射性。比较阻断和未阻断条件下肿瘤和非损伤半球的PET信号及单细胞示踪剂摄取。研究人员对n=10只小鼠静脉注射荧光Dextran，通过共聚焦显微镜研究BBB破坏，并与同一动物的TSPO-PET信号进行相关分析。TSPO-PET显示，与未阻断动物相比，阻断后肿瘤（早期：-72%；晚期：-59%，p<0.001）和对侧半球（早期：-65%，晚期：-63%，p<0.001）的信号显著但不完全降低。研究人员发现，与未阻断小鼠相比，在肿瘤各阶段所有分析细胞组分（肿瘤细胞：-95%，p=0.0039；TAMs：-98%，p<0.0001；剩余细胞：-99%，p=0.0033）中示踪剂摄取几乎完全被阻断。PET信号降低（R=-0.824, p=0.0034）及阻断后残余PET信号（R=0.809, p=0.0046）均与Dextran强度显著相关。实验性胶质母细胞瘤中TSPO-PET信号的特异性在早期肿瘤中达到72%，但在晚期SB28肿瘤中降至59%，原因是BBB破坏的进行性贡献。非特异性TSPO示踪剂摄取由BBB破坏驱动，并完全归属于细胞外区室，而细胞性TSPO示踪剂摄取显示出很强的特异性。

研究背景与目的：胶质母细胞瘤是成人最常见的恶性原发脑肿瘤，确诊后中位生存期不足一年。磁共振成像（MRI）是其主要影像方法，但常低估肿瘤扩展。正电子发射断层扫描（PET）在评估胶质母细胞瘤肿瘤微环境（TME）中日益重要，[¹⁸F]GE-180是针对18 kDa转位蛋白（TSPO）的PET示踪剂，可结合TME内活化髓系细胞及胶质瘤细胞。然而，TSPO-PET信号的特异性、细胞外区室贡献以及血脑屏障（BBB）通透性对信号的影响仍存争议。本研究利用SB28胶质母细胞瘤小鼠模型，联合PET成像、冷示踪剂阻断、注射后细胞分选（scRadiotracing）和Dextran荧光示踪，旨在解析BBB破坏对细胞与细胞外区室TSPO-PET信号分配的影响。

研究方法：研究采用同基因免疫活性SB28小鼠模型，于接种后第1周（早期）和第3周（晚期）进行60 min动态microPET扫描；部分动物扫描前接受25,000倍过量冷GE-180或DPA-714阻断。PET数据通过图像导出输入函数（IDIF）和Logan plot计算分布容积（VT）。肿瘤组织经解离和磁性细胞分选获得肿瘤细胞、肿瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞（TAMs, CD11b(+)）及剩余细胞，结合γ计数与流式细胞术计算每个细胞的放射性（scRadiotracing）。另对n=10只小鼠静脉注射3000 MW荧光Dextran（葡聚糖），用共聚焦显微镜定量BBB破坏，并与同一动物TSPO-PET信号进行相关分析。

研究结果：（1）肿瘤TSPO-PET信号经过量冷配体阻断后呈阶段依赖性降低：在早期SB28肿瘤中，阻断后VT降低72%（p<0.0001），晚期降低59%（p<0.0001）；对侧半球分别降低65%和63%。假手术小鼠接种部位在早期和晚期分别降低68%和61%。绝对VT降幅在肿瘤区域高于非肿瘤组织。使用[¹⁸F]DPA-714验证获得相似阻断效果，离体γ计数亦支持PET结果。上述结果提示肿瘤组织内TSPO相关特异性信号比例较高，但晚期受BBB破坏影响而下降。（2）SB28肿瘤中细胞TSPO示踪剂摄取在阻断后呈强特异性：scRadiotracing显示，早期肿瘤细胞、TAMs及剩余细胞的单细胞放射性在阻断后分别下降98%、99%和99%；晚期分别下降99%、96%和99%。假手术小鼠各细胞组分也下降95%以上。这说明细胞层面的TSPO示踪剂摄取几乎完全可被冷配体竞争性阻断，即细胞性TSPO-PET信号具有很高特异性。（3）BBB破坏与阻断后残余TSPO-PET信号相关：Dextran外渗量（TR Intensity Sum）从早期6.3±2.7×10⁸ a.u.升至晚期4.6±1.3×10⁹ a.u.（p=0.0001）。Dextran强度与残余PET信号显著正相关（R=0.809, p=0.0046），与阻断后PET信号降低程度显著负相关（R=-0.824, p=0.0034）；Dextran强度与GFP（绿色荧光蛋白）强度（肿瘤体积替代指标）高度相关（R=0.969, p<0.0001）。对侧半球Dextran强度低，且与残余PET信号无明显相关。提示非特异性TSPO信号主要源于开放BBB导致的示踪剂细胞外渗漏。（4）TSPO-PET信号在细胞与细胞外区室间的分配：所有细胞组分在阻断后信号下降≥95%，因此非特异性摄取被完全归入细胞外区室，且其大小与Dextran外渗程度一致。基于k-means聚类对肿瘤内异质性区域分析，残余PET信号与特异性PET信号（未阻断减阻断后的差值）无相关（R=0.052, p=0.458）。因此，TSPO-PET信号由肿瘤细胞和TAMs靶表达驱动的特异性细胞性成分与BBB开放所致示踪剂漏出的细胞外非特异成分组成；早期肿瘤中特异性信号占72%，晚期降至59%。

讨论与结论：讨论指出，本研究首次将PET成像、阻断实验、注射后细胞分选和Dextran示踪相结合，解决了[¹⁸F]GE-180在胶质母细胞瘤中信号解释的争议：特异性细胞结合贡献了早期多数信号，而BBB破坏在肿瘤进展中增加细胞外非特异性信号；区域分析不支持BBB渗漏增强特异性细胞摄取。非肿瘤区域相对阻断比例与肿瘤相似，但绝对降幅较低，提示背景信号影响相对比例，离体γ计数支持对侧半球信号来自局部髓系细胞结合而非肿瘤溢出。晚期总PET信号降低被认为与肿瘤细胞和髓系细胞表型变化、坏死及血管重塑有关。研究局限在于仅使用雌性小鼠和单一SB28细胞系。总体结论：非特异性TSPO-PET信号由BBB破坏驱动并完全位于细胞外区室；细胞性TSPO-PET信号完全特异，且不受示踪剂