瓶装饮用水中人类肠道病毒替代病毒（鼠诺如病毒、恒河猴轮状病毒、猪札如病毒）的长期存活研究

《Food and Environmental Virology》：Long-Term Survival of Human Enteric Virus Surrogates (Murine Norovirus, Rhesus Rotavirus, and Porcine Sapovirus) in Bottled Drinking Water

　　

肠道病毒是食源性和水源性疾病的主要原因。由于许多人类肠道病毒的可培养性有限，通常使用替代病毒来模拟其在环境中的持久性。本研究旨在评估鼠诺如病毒（MNV）、恒河猴轮状病毒（RRV）和猪札如病毒（PoSaV）在瓶装饮用水中的长期存活情况，这三种病毒在此用作人类肠道病毒的可培养替代病毒。研究人员将人工接种病毒的瓶装水分别储存在4 °C、25 °C和37 °C条件下，最长储存365天，并使用TCID50法和噬斑法量化病毒感染性，其中噬斑法成功应用于PoSaV的定量。初始病毒浓度为：MNV为5.2 log10 TCID50/mL，RRV为6.5 log10 PFU/mL，PoSaV为4.0 log10 PFU/mL。在4 °C条件下，MNV和RRV在至少一年内保持感染性，而PoSaV逐渐下降，至第55天检测不到。在25 °C条件下，病毒灭活速率加快：MNV至第160天检测不到，RRV至第320天检测不到，PoSaV至第20天检测不到。在37 °C条件下，所有病毒均观察到快速灭活速率，MNV、RRV和PoSaV分别在第20天、第80天和第10天检测不到。这些结果表明肠道病毒在瓶装水中的存活具有显著的温度依赖性。确保瓶装水使用微生物学洁净的水源以及实施有效的食品和水安全管理措施以尽量减少潜在的病毒污染至关重要。

论文解读文章

一、研究背景与意义

世界卫生组织估计，不安全的食品每年导致约6亿人患病和42万人死亡。食源性肠道病毒如诺如病毒、轮状病毒和札如病毒在全球范围内造成大量发病。肠道病毒通过粪-口途径传播，具有高度感染性、环境稳定性强、排泄量大的特点。在美国，2019年诺如病毒约占七种主要病原体导致的本土获得性食源性疾病的56%；在欧盟，诺如病毒是2024年食源性暴发的主要原因。瓶装水在法律上被归类为食品，因此受食品安全法规和微生物质量标准的约束。

由于人类诺如病毒和札如病毒等重要的肠道病毒难以常规培养，实验上易于处理的替代病毒被广泛用于研究病毒在食品和环境系统中的持久性和灭活。鼠诺如病毒（MNV）、恒河猴轮状病毒（RRV）和猪札如病毒（PoSaV）是常用的可培养替代病毒。尽管MNV的持久性已在多种环境和水分质中被研究，但关于这些病毒在瓶装饮用水中长期存活（数月以上）的比较研究仍然缺乏。瓶装水常在不同温度条件下长期储存，并被弱势人群广泛消费，因此开展本项研究具有重要的食品安全意义。

二、研究设计与技术方法

研究人员将MNV、RRV和PoSaV分别接种到商业瓶装饮用水（芬兰Polar Spring泉水）中，储存在4 °C、25 °C和37 °C三个温度条件下，最长监测365天。MNV和RRV监测一年，PoSaV监测55天。病毒感染性分别通过TCID₅₀法（MNV）和噬斑法（RRV和PoSaV）进行定量。MNV在RAW 264.7 γNO(?)细胞中培养，RRV在MA-104细胞中培养，PoSaV在LLC-PK1细胞中培养。所有样品避光储存以排除光灭活效应。每个实验独立进行两次，每次三个培养板各含双复孔，共六个技术重复。数据以均值±标准差表示，统计分析使用GraphPad Prism 10.6.0软件进行多重非配对t检验。

三、研究结果

鼠诺如病毒在瓶装饮用水中的存活

MNV初始回收滴度为5.2±0.3 log₁₀ TCID₅₀/mL。在4 °C条件下，MNV在整个365天储存期内保持感染性，最终滴度为4.6±0.1 log₁₀ TCID₅₀/mL，较第0天显著降低但下降不足1个log₁₀。在25 °C条件下，MNV滴度逐渐下降，至第160天低于检测限。在37 °C条件下，MNV快速灭活，自第20天起检测不到感染性病毒。

恒河猴轮状病毒在瓶装饮用水中的存活

RRV初始恢复滴度为6.5±0.3 log₁₀ PFU/mL。在4 °C条件下，RRV在整个365天储存期内保持感染性，第365天滴度为5.0±0.1 log₁₀ PFU/mL。在25 °C条件下，RRV滴度逐渐下降，至第320天低于检测限。在37 °C条件下，RRV灭活速率加快，至第80天检测不到感染性病毒。RRV在4 °C和25 °C条件下的存活时间均长于MNV。

猪札如病毒在瓶装饮用水中的存活

PoSaV初始恢复滴度为4.0±0.2 log₁₀ PFU/mL。在4 °C条件下，PoSaV滴度逐渐下降，至第55天低于检测限（1.4 log₁₀ PFU/mL）。在25 °C条件下，PoSaV至第20天低于检测限。在37 °C条件下，PoSaV灭活最为迅速，至第10天检测不到感染性病毒。

比较分析

在相同储存条件下，三种病毒表现出明显的温度依赖性存活模式。在4 °C条件下，MNV和RRV在12个月内保持感染性，而PoSaV在第55天检测不到。在25 °C条件下，RRV、MNV和PoSaV分别在第320天、第160天和第20天低于检测限。在37 °C条件下，RRV、MNV和PoSaV分别在第80天、第20天和第10天检测不到。三种病毒的环境稳定性从高到低依次为RRV、MNV、PoSaV。

四、讨论与结论

讨论部分指出，MNV在4 °C瓶装水中至少一年保持感染性，与Zhao等人的研究结果一致，但与其他研究在泉水或地表水中观察到的更快衰减不同，这种差异可能源于水分质、初始病毒滴度和实验条件的不同。RRV在4 °C条件下的长期存活与既往研究相符，表明轮状病毒在低温水环境中可长期存活。PoSaV在所有温度条件下均表现出较低稳定性，这与其较低的初始滴度和特定的培养条件（需使用胆汁酸）可能有关。

研究存在一定局限性：采样间隔较宽导致无法精确确定灭活时间；使用替代病毒可能不能完全反映人类致病病毒的持久性特征；不同病毒初始滴度不完全一致。但本研究的优势在于所有病毒在完全相同的实验条件下进行评估。

研究结论为：MNV、RRV和PoSaV可在瓶装饮用水中长期存活，感染性随时间逐渐下降而非快速灭活。MNV和RRV在4 °C条件下至少一年保持感染性。病毒灭活速率随温度升高而加快。不同病毒间的存活差异表明，病毒存活特性取决于病毒结构和性质以及环境条件。这些发现为肠道病毒在饮用水系统中的持久性提供了重要见解，强调了洁净原水、有效水处理和监测策略对瓶装饮用水安全的重要性。未来应纳入人类致病病毒和更复杂的环境条件进行研究，以更好地评估现实风险并改善食品安全和公共卫生保护。