人类分娩启动的离体模型研究

《Reproductive Sciences》：An Ex Vivo Model for the Onset of Human Labor

　　

论文摘要翻译：

在妊娠期间，子宫肌层保持松弛状态，但在临近足月时发生表型转化，从而启动分娩。这一过程伴随收缩相关蛋白（contraction-associated proteins，CAPs）表达上调及舒张相关蛋白（relaxation-associated proteins，RAPs）表达下调，进而促进产生强有力的同步收缩以娩出胎儿。研究人员目前尚未完全了解人类子宫肌层从非临产表型向临产表型转变过程中所涉及的生化信号通路和生理变化。建立人类分娩启动的离体模型可扩展研究人员对该过程的认识。本研究旨在评估体外培养的非临产孕妇子宫肌层是否发生与向临产样表型转变一致的表型转化。研究人员收集了足月非临产孕妇的子宫肌层活检组织，其中一小部分立即冷冻保存（0 h时间点），其余组织被解剖为小块，在无血清培养基中孵育48小时后冷冻保存。采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）评估关键子宫肌层基因mRNA丰度的变化，并通过蛋白质印迹法（Western blotting）定量蛋白水平。数据使用GraphPad Prism软件进行分析。离体培养48小时后，子宫肌层中关键CAPs（包括GJA1、ESR1、PTGS2、NFκB1、NFκB3、IL1β、IL6和AKR1C1）的表达显著增加，而RAPs（PLCL1、HSPB1和HSPB6）的表达显著降低。足月非临产孕妇子宫肌层组织块在48小时离体培养期间经历了协调的分子重塑，其中许多变化与体内足月临产时报道的变化相一致。这些研究结果支持将延长组织块培养作为朝向临产样状态分子转变的模型，同时也表明培养的非临产组织块可能不再忠实代表原始的非临产表型。

论文解读：

一、研究背景与目的

人类子宫肌层在妊娠期间维持静息状态，但在足月临近时经历表型转化，进而启动分娩。该过程表现为收缩相关蛋白（CAPs）表达上调，以及舒张相关蛋白（RAPs）表达下调，最终促进强有力的同步子宫收缩以娩出胎儿。然而，目前对人类子宫肌层从非临产表型向临产表型转变的生化信号通路和生理变化仍然缺乏充分理解。由于伦理限制，人类妊娠研究难以在临床试验之外开展，因此既往研究多依赖于二维（2D）和三维（3D）细胞培养模型以及离体活检组织。虽然细胞模型提供了便利的实验工具，但无法完整保留组织的多细胞组成、细胞外基质和三维组织架构。近年来，离体组织块培养因其能够更好地保留体内表型而受到重视，但已有研究表明离体培养的组织块仍会出现培养诱导的基因表达变化。研究人员前期研究发现，非临产子宫肌层组织块在48小时培养过程中，OXTR表达显著下降，而ESR1、PTGS2、PR-A和AKR1C1表达显著上升，这些变化均与体内临产启动时观察到的变化一致。基于上述发现，研究人员提出假说：非临产子宫肌层在离体培养为组织块时，会向“临产样”状态转变。本研究旨在系统评估足月非临产孕妇子宫肌层在离体培养过程中是否发生向临产样表型的转化，从而建立一种人类分娩启动的离体模型。

二、研究方法概述

研究人员收集了30例足月（妊娠38.3–39.5周）非临产孕妇的子宫肌层活检组织，样本来源于剖宫产术中子宫下段切口上缘。每例样本的一部分立即置于液氮中冷冻作为0 h基线对照，其余组织被解剖为约2×2×2 mm的组织块，在无血清DMEM培养基中于37°C、95%空气/5% CO₂条件下孵育48小时，每24小时更换培养基。培养结束后将组织块冷冻保存。研究采用qRT-PCR检测30个目标基因的mRNA丰度变化，以Alien RNA为内参；采用蛋白质印迹法（Western blotting）对其中8个蛋白（GJA1、OXTR、PTGS2、AKR1C1、PLCL1、HSPB1、HSPB5和HSPB6）进行蛋白水平定量。数据使用GraphPad Prism软件进行配对t检验统计分析。

三、研究结果

（一）离体培养后编码关键收缩相关蛋白及子宫肌层功能调节基因的表达变化

48小时离体培养后，GJA1、ESR1、PTGS1、PTGS2、HPGD、AKR1C1、SRD5A1和MED17的mRNA表达均显著增加（p均<0.001），其中PTGS2升高倍数最大，达171倍；而OXTR表达显著降低（p=0.0011），降至0 h基线的0.35倍。这些变化与体内临产启动时CAPs表达上调的趋势基本一致。

（二）离体培养后炎症介质的表达变化

培养48小时后，NFκB1、NFκB3、TNFα、IL1β、IL6、IL8、PLCL2和TRPV4的mRNA表达均显著增加（p均<0.001），其中IL8升高达6.14×10³倍；而PLCL1表达显著降低（p=0.0001）。炎症因子的大幅上调与临产启动时子宫肌层发生的无菌性炎症反应一致。

（三）离体培养后小热休克蛋白的表达变化

48小时培养后，HSPB5（编码αB-晶状体蛋白）的mRNA表达显著增加（p<0.0001），而HSPB1（编码HSP27）和HSPB6（编码HSP20）的mRNA表达显著降低（p分别为0.0001和0.0023）。HSPB5升高至基线的3.74倍，HSPB1和HSPB6分别降至基线的0.49倍和0.53倍。

（四）离体培养期间磷酸二酯酶亚型的表达变化

培养48小时后，PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE5A、PDE7A、PDE7B和PDE8A的mRNA表达均显著增加（p均<0.01），其中PDE4B升高达28.0倍；PDE8B表达无显著变化（p=0.9029）。PDE是水解cAMP和cGMP的关键酶，其表达变化可能影响子宫肌层的舒张状态。

（五）离体模型内蛋白水平变化的评估

蛋白水平检测结果显示，GJA1（p=0.0020）和PTGS2（p=0.0010）蛋白水平在培养48小时后显著升高，而OXTR蛋白水平虽有下降趋势但未达统计学意义（p=0.1292）。PLCL1蛋白水平显著下降（p=0.0429），AKR1C1蛋白水平显著上升（p=0.0005）。HSPB5蛋白水平显著上升（p=0.0004），HSPB6蛋白水平显著下降（p=0.0322），而HSPB1蛋白水平无显著变化（p=0.3453）。

四、讨论与结论

将本研究的mRNA和蛋白水平数据与研究人员前期发表的PR-A/PR-B结果合并分析后发现，共有14个基因的表达变化与体内临产启动时已知的变化方向一致，包括ESR1、GJA1、OXTR、PTGS2、PR-A、PR-B、AKR1C1、TNFα、IL1β、IL6、IL8、PLCL1、HSPB1和HSPB6。仅有PTGS1、SRD5A1和PDE8B的表达变化可能与体内临产启动不完全一致，但已有研究表明这些基因在人类分娩中发挥较为次要或代偿性作用。其余15个基因因缺乏体内临产启动时表达变化的明确证据，无法确认其变化是否与体内过程一致。

研究表明，足月非临产孕妇子宫肌层组织块在48小时离体培养过程中经历了朝向临产样分子表型的协调重塑。这一现象具有两方面的重要意义：第一，长期培养的非临产子宫肌层组织块可能不再忠实代表原始的非临产状态，这对以静息期子宫肌层为研究对象的实验设计构成了需要重视的方法学限制；第二，这种可重复获得的临产相关分子特征为研究人类子宫肌层激活和分娩启动的机制提供了一个实验上可及的离体系统，可用于时序分析、早期应答基因鉴定以及候选触发因子和抑制剂的测试。该模型的优势在于保留了组织的多细胞组成、细胞外基质和三维架构，且采用配对设计减小了个体间变异的影响。研究局限性包括：仅比较了0 h和48 h两个时间点、未进行功能学验证（如自发收缩活性和宫缩剂反应性）、检测基因数目有限、炎症介质仅在mRNA水平评估、以及离体培养环境与体内环境的固有差异。未来研究应覆盖更全面的时间序列（如1、2、6、24小时和72、96、120小时），并整合转录组学和蛋白质组学分析，以进一步验证该模型的可靠性。

总之，足月非临产孕妇子宫肌层组织块在48小时离体培养中发生显著的分子重塑，涉及收缩、炎症、类固醇调节、前列腺素、钙信号和环核苷酸等多条通路，其中多数变化与体内临产启动时的变化一致，支持培养的非临产子宫肌层获得临产样分子表型的观点。这一发现既揭示了长期组织块培养在模拟非临产状态时的重要局限性，又为研究人类子宫肌层激活和分娩启动机制提供了具有潜在价值的离体实验系统。