## 中文标题 长叶车前草与多年生黑麦草代谢物特征对土壤微生物群落结构及生物硝化抑制（BNI）的影响

《Plant and Soil》：Plantago lanceolata and Lolium perenne metabolite profiles, their impact on soil microbial community structures and soil biological nitrification inhibition

　　

**背景与目的** 过量施用化肥和集约化农业产生的过量硝酸盐（NO₃^?）可污染水体，并促成温室气体（氧化亚氮——N₂O）的产生。来自牧场草本植物（如长叶车前草 *Plantago lanceolata*）的植物代谢物能够抑制微生物将铵（NH₄⁺）氧化为NO₃^?的过程（即生物硝化抑制——BNI），并改变土壤氮循环动态（降低潜在硝化速率——PNR）。本研究的主要目标是探究不同土壤类型中与BNI及PNR降低相关的差异植物代谢物表达。

**方法** 研究人员对六个车前草品种进行了BNI潜力测试，并筛选了与抑制氨氧化细菌（AOB）*Nitrosospira multiformis*相关的代谢物。随后，研究人员在四种不同的新西兰土壤中种植车前草品种‘Agritonic’和黑麦草品种‘One50’，考察了PNR及微生物组的变化。

**结果** 车前草处理下的PNR较休耕土壤低11%–41%，而黑麦草处理下的PNR较休耕土壤低0%–39%。除毛蕊花糖苷（verbascoside）和桃叶珊瑚苷（aucubin）外，与PNR降低相关的车前草代谢物还包括大车前苷（plantamajoside）、核黄素-3-和5-硫酸酯（riboflavin 3- and 5-sulfate）以及车前草胍酸（plantagoguanidinic acid）。绿原酸（chlorogenic acid）与黑麦草处理下PNR的降低相关。PNR降幅、微生物组结构以及氨氧化古菌（AOA）相对氨氧化细菌（AOB）的比值均受土壤类型调节。

**结论** 车前草和黑麦草在四种不同土壤中均降低了PNR，并且这种降低与除桃叶珊瑚苷和毛蕊花糖苷之外的多种代谢物相关。基于所鉴定的候选BNI相关代谢物，研究人员假设PNR的降低可能通过螯合等间接机制实现，并且似乎同时依赖于植物生理学和土壤物理化学性质。

## 论文解读

**一、研究背景与目的**

在集约化管理的农业生态系统中，过量施用氮肥导致硝酸盐（NO₃^?）淋溶对水质造成污染，同时气态氮（N）排放（尤其是氧化亚氮N₂O）加剧了温室效应。传统观点认为土壤氮循环主要受微生物调控，但近年研究表明，植物根系分泌的次生代谢物可通过直接或间接方式影响微生物的氮代谢，这类天然化合物被称为生物硝化抑制剂（biological nitrification inhibition, BNI）。BNI能够延缓铵（NH₄⁺）向亚硝酸盐（NO₂^?）进而向NO₃^?的转化，从而降低氮素淋失和N₂O排放。尽管合成硝化抑制剂（如硝吡啉、3,4-二甲基吡唑磷酸盐）已证明有效，但其成本高、半衰期短、可能残留于食物链等缺陷限制了其应用。因此，利用植物根系原位释放BNI被认为是一种低成本、可持续的替代途径。

长叶车前草（*Plantago lanceolata*）是新西兰牧场中广泛使用的草本植物，其体内富含桃叶珊瑚苷（aucubin）、梓醇（catalpol）和毛蕊花糖苷（verbascoside）等酚类及环烯醚萜苷类次生代谢物。已有研究表明，将车前草混播于牧场可显著减少尿液斑块下的氮淋溶（降幅可达45%以上），并降低N₂O排放。然而，以往研究存在以下问题：多数仅测定地上部或地下部生物量中少数已知化合物的含量，缺乏对根际土壤中实际分泌代谢物的系统分析；对土壤类型、混合草地效应和微生物群落变化如何影响BNI效果知之甚少；现有研究多使用单株硝化微生物进行体外生物测定，难以反映田间复杂环境中多种微生物的聚合响应。为此，研究人员设计了三项实验目标：（1）筛选多个车前草品种的BNI潜力并检测主要相关代谢物；（2）鉴定其他BNI相关代谢物，特别是分泌到土壤中的化合物；（3）探究土壤类型和根际微生物组变化对BNI/PNR变异的影响。

**二、研究内容与意义**

研究人员首先利用水培系统对六个车前草品种（‘Agritonic’及育种系B–F）进行BNI活性筛选，并采用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）对其叶、根组织进行代谢物谱分析。随后，选取具有代表性BNI活性的品种‘Agritonic’和黑麦草品种‘One50’，在来自新西兰三个地区的四种土壤（Waikato gley、Waikato allophanic、Manawatū pallic、Canterbury pallic）中进行90天盆栽试验，测定潜在硝化速率（PNR）、根际土壤代谢物、土壤化学性质及微生物群落结构。该研究鉴定出一系列新的候选BNI相关代谢物，证明了BNI可能通过间接机制（如金属螯合）起作用，并揭示了土壤类型对植物-微生物相互作用的显著调节作用。这对于理解牧场生态系统中植物介导的氮循环调控机制、优化草种混播策略以及减少农业面源污染具有重要意义。

**三、主要技术方法**

研究人员采用的关键技术方法包括：（1）水培根系分泌物收集并结合以氨氧化细菌（AOB）*Nitrosospira multiformis*（ATCC? 25,196?）为指示菌的格里斯试剂生物测定法评估BNI活性；（2）UHPLC-MS对植物叶、根组织及根际土壤进行靶向定量与非靶向代谢组学分析，通过Compound Discoverer及多元统计筛选差异代谢物；（3）以四种新西兰土壤（Waikato gley、Waikato allophanic、Manawatū pallic、Canterbury pallic）为培养介质，利用双室根箱种植植物90天，以摇浆培养法测定PNR；（4）利用16S rRNA基因扩增子测序（细菌V3-V4区、古菌V4-V5区）解析根际土壤细菌和古菌群落结构；（5）通过实时荧光定量PCR（qPCR）定量细菌和古菌氨单加氧酶基因（amoA）的相对丰度。

**四、研究结果**

**（1）水培植物的BNI活性与代谢物谱**

六个车前草品种的根际分泌物在1 mg mL^?1浓度下的BNI活性平均为22%–42%，品种间存在较大变异，但统计支持不足。通过k-means聚类将品种划分为低（14%–23%）、中（28%–36%）、高（41%–66%）三个BNI区间。在叶组织中，与BNI活性正相关的最显著标志物为大车前苷（plantamajoside），而非先前重点关注的目标毛蕊花糖苷；核黄素-3-硫酸酯和核黄素-5-硫酸酯也被鉴定为相关代谢物。在根组织中，与高BNI相关的化合物包括车前草胍酸（plantagoguanidinic acid）及其衍生物、核黄素硫酸酯以及桃叶珊瑚苷。值得注意的是，桃叶珊瑚苷在叶片中的浓度与预期BNI呈负相关，而黑麦草叶片中表达较高的隐绿原酸和根中的异绿原酸、leontopodic acid等化合物则构成其区别于车前草的代谢特征。

**（2）土壤类型对植物代谢物组及PNR的影响**

在四种土壤中，车前草处理下PNR较休耕对照降低11%–41%，其中Manawatū pallic土壤降幅最大（41%），Canterbury pallic（33%）、Waikato gley（15%）和Waikato allophanic（11%）依次降低；黑麦草处理下PNR降低0%–39%，其中Canterbury pallic降幅为39%、Manawatū pallic为27%、Waikato gley较小，而Waikato allophanic中未观察到显著降低。根际土壤代谢组学分析检测到车前草根际中特有的桃叶珊瑚苷元（aucubigenin）、车前草胍酸、geniposidic acid、10-benzoylcatalpol等化合物，部分化合物浓度变化跨度高达五个数量级。Fe-天然有机质复合物在休耕土壤中浓度较高，而植物根际中较低，提示根系分泌物可能通过有机酸等化合物改变根际金属螯合状态。

**（3）根际微生物群落结构与硝化微生物**

细菌群落的α多样性（Chao1和Shannon指数）在植物处理间无显著差异；β多样性的非度量多维尺度分析（nMDS）和PERMANOVA显示，细菌群落结构主要由土壤类型决定，而非植物处理。相比之下，古菌群落的α和β多样性均同时受土壤类型和植物处理影响，车前草处理下的古菌群落与黑麦草和休耕处理显著不同，且这一差异主要由Waikato gley土壤驱动。amoA基因qPCR分析表明，土壤类型对AOB与氨氧化古菌（AOA）的相对比例影响远大于植物处理：allophanic土壤中AOB相对丰度较高，pallic土壤中AOA相对丰度较高。AOA优势属为Candidatus Nitrosocosmicus，占pallic土壤AOA群落的约30%，而Nitrososphaera仅在allophanic土壤中检出。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，BNI相关的代谢物多样性远超出先前对桃叶珊瑚苷和毛蕊花糖苷的单一认知。候选BNI代谢物多具有抗氧化或金属螯合活性，如核黄素硫酸酯与铁（Fe）的螯合、车前草胍酸的胍啶结构对Cu²⁺/Fe²⁺等金属辅因子的潜在结合能力，可能通过剥夺氨单加氧酶（AMO）所需的金属辅因子而间接抑制硝化。此外，绿原酸等酚酸类物质可能通过清除一氧化氮（NO）等活性氮中间产物干扰氨氧化过程。土壤类型通过调节AOA/AOB比值、有机质含量和微生物群落结构，显著影响BNI效果：allophanic土壤虽具有最高的PNR，但车前草对其PNR的相对降幅仅为pallic土壤的三分之一，这可能与较高的有机碳含量促进了异养微生物对NH₄⁺的竞争或加速了BNI化合物的降解有关。研究人员还强调，黑麦草在部分土壤中表现出与车前草相当的PNR降低能力，其机制与绿原酸等化合物有关。总体而言，黑麦草和车前草的BNI效应依赖于植物生理状态与土壤理化性质的相互作用。

研究结论：本研究的总体假设——即BNI相关代谢物的差异表达刻画了不同土壤类型下的BNI能力和PNR变异性——在广义上得到了支持，但这一假设过于简化。土壤理化性质、植物生理状态与土壤微生物群落之间存在多重反馈，共同影响植物代谢物表达、氮循环速率和PNR。仅量化地上生物量中毛蕊花糖苷、桃叶珊瑚苷和梓醇来判定车前草的BNI活性存在不足，大车前苷和核黄素硫酸酯等化合物可能更具指示价值。研究提出的候选BNI代谢物可能通过间接机制发挥作用，包括螯合关键微量金属元素以及抗氧化剂清除NO等氮循环中间产物，但上述机制仍需直接实验验证。此外，多年生黑麦草也表现出与车前草相当的BNI潜力，其机制可能类似；土壤化学环境对微生物群落结构的影响大于植物处理，只有古菌群落表现出对根系分泌物的显著响应，这进一步影响了植物源BNI化合物的效能和PNR的广泛变异性。