低氧条件下光动力疗法的体外评估：光化学路径与方法学挑战

《Biophysical Reviews》：Assessing photodynamic therapy under in vitro hypoxia: photochemical pathways and methodological challenges

　　

光动力疗法（PDT）是一种光激活的治疗方式，通过光敏剂触发的活性氧（ROS）杀伤细胞，但其疗效受到氧气可用性以及光化学反应是通过I型还是II型途径进行的强烈影响。在富氧环境中，II型PDT主要产生单线态氧（1O2），而低氧会抑制这一途径，并将关注点转向产生自由基物种（如超氧阴离子（O2•?）、羟基自由基（•OH）和过氧化氢（H2O2））的I型机制。本综述认为，体外观察到的低氧驱动的耐药性并不能仅由氧气耗竭来解释，而是光化学路径选择、细胞适应性、光敏剂摄取与定位以及检测方法局限性之间相互作用的结果。综述强调，低氧可以重塑膜组成、囊泡运输和细胞器靶向，进而改变ROS模式与光损伤结果。在方法学上，该研究推荐采用受控的低氧模型，包括二维（2D）低氧培养和三维（3D）球体模型，并结合正交读出来检测低氧与氧化损伤。对于ROS谱分析，建议在常氧和低氧条件下使用针对总ROS、超氧阴离子、羟基自由基和单线态氧的探针进行比较，因为单一检测无法捕捉完整的机制图像。最后，综述强调在低氧PDT中应谨慎解读脂质和蛋白质氧化数据，因为FOX、TBARS、碘量法和BODIPY-C11等方法主要报告次级或局部产物，除非与成像、膜完整性检测和时间分辨测量相结合，否则可能遗漏I型驱动的损伤。

主体内容总结

引言

光动力疗法（PDT）是一种依赖光敏剂（PS）激发产生能够诱导氧化损伤和细胞死亡的活性氧（ROS）的光激活治疗方式。光激发后，PS布居至激发单重态和三重态，从而启动两种主要的光化学途径：基于能量转移至分子氧以产生单线态氧（¹O₂）的II型机制，以及涉及电子或氢转移反应生成自由基物种如超氧阴离子（O₂^•?）、羟基自由基（^•OH）和过氧化氢（H₂O₂）的I型机制。¹O₂的产生依赖于三重态-三重态能量转移（TETT）。在I型途径中，O₂^•?被认为是首要的ROS，并可进一步生成过氧化氢自由基（HOO^•）、H₂O₂和^•OH。^•OH对几乎所有生物分子都具有极强的破坏性。传统上，PDT被概念化为一个以II型为主的过程，但实体瘤微环境中氧气高度有限，且光照期间的额外氧气消耗严重损害¹O₂生成，使氧气依赖性成为PDT在实体瘤中失败的核心原因。为此，近期研究从纯¹O₂中心设计转向能够节约氧气或在低至可忽略的O₂水平下高效运作的PS和光化学方案。混合I型/II型系统已被证明可以通过自由基介导的光化学部分规避氧气依赖性。这些进展推动了I型和I/II型光动力剂的理性设计原则，然而PS的光物理表征仍主要基于空气饱和溶液中的测量，而氧气依赖的自由基产率及其在低氧下的演变很少被系统量化。因此，仅优化¹O₂量子产率的PS在低氧细胞实验中表现不佳。体外模拟低氧是理解细胞层面PDT耐药性的关键步骤，可通过物理方法（如低氧培养箱或模块化腔室，通常维持1-5% O₂）实现。传统的二维（2D）单层培养无法再现肿瘤特征性的氧气梯度和扩散限制，而三维（3D）球体则能提供更生理相关的低氧微环境。低氧肿瘤环境不仅限制了II型光过程的氧气供应，还通过缺氧诱导因子1（HIF-1）驱动通路重塑细胞代谢、改变膜脂质组成、调节囊泡运输及转运蛋白表达，从而影响PS的摄取和亚细胞定位。在分子层面，低氧下的PDT耐药性与主导ROS物种的转变以及抗氧化防御能力的改变有关。此外，许多经典的氧化损伤检测方法在低氧条件下可能低估或扭曲损伤的程度和性质。综上所述，体外低氧下观察到的PDT耐药性并非仅是氧气减少的直接后果，而是源于竞争性光化学途径、低氧驱动的细胞适应以及用于评估PDT效果的模型和检测方法固有局限性之间的复杂相互作用。本综述旨在提供一个实验路线图，帮助选择和评估新一代PS在低氧肿瘤环境中的应用。

体外低氧方法

体外低氧模型对于剖析氧气可利用性和微环境结构如何塑造PDT反应至关重要，特别是在比较II型与I/II型PS时。这些模型可分为常见的2D细胞培养和能产生内在氧气梯度及扩散屏障的3D平台。

2D单层培养

在2D单层细胞培养中，最常用的低氧实现方式是使用气体控制培养箱或模块化腔室，将细胞维持在1-5% O₂环境下24-48小时，以实现HIF-1α的稳定化和代谢适应。商业化的模块化培养箱腔室，如连接预混气瓶的聚碳酸酯单元，允许精确调节O₂、CO₂和湿度，可作为专用低氧工作站的低成本替代方案。“真空袋”技术也是一种简单的方法，无需专门设备即可创建低氧环境。在这些条件下，多项研究报告了经典II型PS的¹O₂产量和PDT效果显著降低。化学低氧模拟剂，如氯化钴（CoCl₂）和去铁胺（DFO），通过在常规培养箱中稳定HIF-1α或降低线粒体氧气消耗来提供补充方法，但它们不能完全重现扩散受限的氧气梯度，并可能引入脱靶毒性。除了控制外部氧气张力外，必须使用正交读数来验证细胞是否真正处于低氧状态。HIF-1α的稳定化和核积累通常通过免疫印迹或免疫荧光进行评估。其他补充检测包括氧气敏感荧光探针、荧光素酶低氧报告基因以及哌莫硝唑加合物检测。

3D球体细胞模型

3D细胞培养比2D培养能提供更准确的细胞生长场景数据。在2D培养中，细胞形状趋于扁平细长，而在3D培养中，细胞的自然形态得以保留，允许细胞间相互作用。为了模拟并更好地理解PDT中光敏药物在肿瘤模型中的作用，3D球体已被广泛使用。球体可以紧密模拟肿瘤的特性，是具有坏死核心和存活细胞层的3D细胞聚集体，是衡量氧气扩散和消耗效应的优秀模型。球体的尺寸和低氧区域决定了它们的生长、行为、相互作用和对外部环境的响应。一些细胞系能够形成球体，而其他细胞类型只能形成细胞聚集体。只有当球体直径大于150 μm时，细胞异质性和代谢梯度才变得明显；而当直径达到约500 μm时，才会出现明显的坏死和低氧中心区。与3D培养相关的挑战之一是成像质量，对于大型球体，光传输会下降。许多PS具有荧光发射特性，可用于动态可视化其在细胞和亚细胞水平的摄取和定位。例如，一项使用膀胱癌球体模型的研究发现，竹红菌素和苯并卟啉衍生物在球体内的分布优于铝酞菁氯化物和原卟啉IX。另一项近期研究中，构建了MCF-7人乳腺癌肿瘤球体，并在存在PS的情况下于常氧和低氧条件下施加不同波长的光，结果显示在常氧条件下408 nm光照射杀灭细胞效率更高，而低氧微环境中的细胞表现出最小的PDT诱导死亡。因此，将球体系统地纳入临床前PDT研究是提高实验结果转化相关性的重要一步。

常氧和低氧条件下的ROS测量

ROS是一个统称，指比分子氧更具活性的含氧分子，包括¹O₂、O₂^•?、H₂O₂、^•OH和HOO^•。在PDT中，这些物种的相对贡献强烈依赖于氧气可用性。在低氧下，通过经典II型途径形成的¹O₂随pO₂下降而减少，而电子转移介导的I型途径可能仍然有效并变得相对更重要。因此，比较常氧和低氧条件下的ROS生成有助于区分PS主要通过II型、I型还是混合光敏机制发挥作用。

总ROS检测

2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）是一种广泛使用的荧光探针，用于检测ROS和评估细胞内的总体氧化应激。该探针进入细胞后被酯酶水解为非荧光的DCFH，DCFH随后与多种ROS反应生成高荧光的DCF。DCFH-DA检测通常用作初步的半定量筛选工具，以比较常氧和低氧条件下的总体ROS生成。在常氧下，荧光增强通常反映光照诱导的整体氧化爆发。在低氧下，DCF荧光的持续存在可能表明与I型光化学相关的低氧依赖性ROS生成途径。值得注意的是，DCFH-DA是一种广谱氧化应激指示剂，缺乏对单个活性物种的特异性，因此建议包含适当的对照。

超氧阴离子（O₂^•?）检测

O₂^•?具有选择性反应性。在简化系统中，可通过超氧化物歧化酶（SOD）可抑制的细胞色素c还原来定量。在细胞系统中，常用二氢乙啶（DHE）或其线粒体靶向类似物MitoSOX氧化产生的荧光进行检测。