《Brazilian Journal of Microbiology》：Organic acid-associated antimicrobial and antibiofilm activity of Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 against Acinetobacter baumannii and Staphylococcus aureus
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鉴于生物膜在细菌耐药性中的重要意义，以及对病原微生物创新疗法的需求，使用益生菌作为抗菌剂的替代策略应运而生。本研究旨在评估鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469）无细胞上清液（cell-free supernatant
鉴于生物膜在细菌耐药性中的重要意义，以及对病原微生物创新疗法的需求，使用益生菌作为抗菌剂的替代策略应运而生。本研究旨在评估鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469）无细胞上清液（cell-free supernatant, CFS）对具有生物膜形成能力的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株的抗菌及抗生物膜活性。研究人员评估了CFS对A. baumannii ATCC 19606、A. baumannii 301、S. aureus ATCC 12598和S. aureus ATCC 29213的活性。在不同CFS稀释度下，分别评估了对浮游细胞的抗菌活性、对生物膜形成的抑制能力以及对成熟生物膜的破坏作用。同时采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）测定了乳酸和乙酸的对应浓度。CFS表现出较高的抗菌活性，在测试的两个最高浓度（197.8/108.7和107.0/54.5 mM乳酸/乙酸）下，生长抑制率为88.26%至100%；在57.8/28.3 mM浓度下，生长抑制率为60.05%至81.65%；而在27.2/13.5 mM浓度下，生长抑制率为21.12%至41.03%。CFS还强烈抑制生物膜形成，抑制率为66.17%至100%，而对成熟生物膜的破坏率为24.75%至88.11%。HPLC分析证实CFS中存在乳酸和乙酸，其中乳酸是检测到的主要有机酸。将CFS中和至pH 7.0后，其抗菌和抗生物膜活性显著降低，表明酸度和酸相关组分在观察到的效应中具有重要贡献。总体而言，鼠李糖乳杆菌ATCC 7469 CFS对A. baumannii和S. aureus表现出显著的抗菌和抗生物膜活性，支持进一步研究乳杆菌来源的CFS作为潜在局部抗菌策略。
论文解读
一、研究背景与目的
细菌生物膜是由微生物群落产生的胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）构成的复杂结构，有利于细菌黏附至生物或非生物表面。生物膜内的细菌在代谢上显著区别于纯培养中的浮游细菌，其对抗生素和消毒剂的抵抗力更强，是临床慢性感染和耐药性传播的重要原因。2017年世界卫生组织（WHO）发布了需优先研发新药的耐药菌清单，其中ESKAPE类病原体被列为关键优先级或高优先级，包括鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等，提示针对这些病原体开发新型治疗策略的紧迫性。
近年来，益生菌作为天然、安全且具有促健康特性的抗菌替代方案受到关注。乳酸杆菌（Lactobacillus spp.）可通过产生细菌素、生物表面活性剂、过氧化氢和乳酸等物质发挥抗病原微生物作用，其无细胞上清液（cell-free supernatant, CFS）已被证明对多种临床相关病原菌具有抗菌和抗生物膜活性。然而，不同益生菌菌株的活性成分及作用机制存在差异，需要针对具体菌株进行系统评估。本研究即在此背景下开展，旨在评估鼠李糖乳杆菌L. rhamnosus ATCC 7469 CFS对两种临床重要病原菌——A. baumannii和S. aureus的浮游细胞生长、生物膜形成和成熟生物膜破坏的影响，并对其中的活性有机酸进行定性和定量分析。
二、研究内容与技术方法
研究人员首先将L. rhamnosus ATCC 7469（来源于巴西奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF MS鉴定）在MRS培养基中培养后离心并过滤获得CFS，并将部分CFS用NaOH调至pH 7.0实现中和。实验所用病原菌包括A. baumannii ATCC 19606、A. baumannii 301、S. aureus ATCC 12598和S. aureus ATCC 29213，均来源于巴西南里奥格兰德联邦大学医学院新药开发实验室菌株库。采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）以评价抗菌活性；采用结晶紫染色法在96孔板中评价CFS对生物膜形成的抑制和对成熟生物膜的破坏作用；采用高效液相色谱（HPLC）测定CFS中乳酸和乙酸的浓度；同时测定不同稀释度CFS的pH值。所有实验均设三次重复，数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验进行统计学分析，显著性水平设为p＜0.05。
三、研究结果
（一）抗菌活性测定（MIC）
CFS对浮游细胞表现出浓度依赖性抗菌活性。在乳酸/乙酸浓度为197.8/108.7 mM（1:2稀释）时，对S. aureus ATCC 12598的生长抑制率为96.71%，对A. baumannii各菌株的抑制率接近100%；在107.0/54.5 mM（1:4稀释）时，抑制率为88.26%至约100%；在57.8/28.3 mM（1:8稀释）时，抑制率为60.05%至81.65%；在27.2/13.5 mM（1:16稀释）时，抑制率降至21.12%至41.03%。高浓度组与对照组相比差异具有统计学意义（p＜0.001），低浓度组差异为p＜0.05。中和至pH 7.0的CFS在测试浓度下几乎完全丧失抗菌活性。基于上述结果，后续抗生物膜实验选用1:2、1:4和1:8三个稀释度，放弃1:16稀释度。
（二）抗生物膜形成抑制
所有受试菌株均被鉴定为生物膜形成菌株。在1:2、1:4和1:8三个CFS稀释度下，生物膜形成抑制率分别为：A. baumannii ATCC 19606为99.37%、98.69%和98.79%；A. baumannii 301为99.24%、98.30%和84.82%；S. aureus ATCC 12598为100%、93.61%和66.17%；S. aureus ATCC 29213为95.07%、94.57%和83.73%。各浓度下CFS处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义（p＜0.001）。pH 7.0中和后的CFS无明显的生物膜形成抑制效果。
（三）成熟生物膜破坏
在1:2、1:4和1:8稀释度下，CFS对预形成成熟生物膜的破坏率为24.75%至88.11%，总体上浓度越高破坏效果越强，且各浓度下处理组与对照组差异均具有统计学意义。中和后的CFS未观察到明显的成熟生物膜破坏作用。
（四）CFS的pH值
随CFS稀释度从1:2增大至1:16，pH值依次为3.6、4.1、5.3和6.0，呈现逐渐升高的趋势，与稀释后抗菌和抗生物膜活性的降低相伴随。
（五）CFS中有机酸谱
HPLC分析证实CFS中含有乳酸和乙酸，其中乳酸为主要有机酸。乳酸浓度在1:2至1:16稀释度下依次为17.82、9.64、5.21和2.45 g/L，乙酸浓度依次为6.53、3.27、1.70和0.81 g/L，两种有机酸浓度随稀释度增加均逐渐下降，与生物活性降低的趋势一致。
四、讨论与结论
有机酸的产生被广泛认为是乳酸杆菌对抗病原菌的重要机制之一。本研究通过HPLC证实CFS中乳酸和乙酸的存在，且有机酸浓度降低与抗菌及抗生物膜活性下降相伴随，提示有机酸是活性的重要物质基础。乳酸作为主要有机酸，其未解离形式可通过膜渗透进入细菌胞内，导致胞内酸化、代谢途径紊乱、ATP耗竭和膜失稳；乙酸则可增加膜通透性并损害能量代谢，二者协同可能增强抑制效果。pH测定显示，CFS稀释度增大伴随pH值升高，并与活性下降相伴随；中和实验进一步证实酸度对抗菌效应有重要贡献，但也提示不能将活性完全归因于pH本身，还涉及有机酸解离状态的变化。
革兰氏阳性菌（S. aureus）和革兰氏阴性菌（A. baumannii）的细胞包膜结构存在差异，理论上可能影响有机酸的敏感性和渗透性。但本研究中两种细菌对CFS的敏感程度并未显示出统一的规律性差异，抑菌效果因菌株和评估指标而异，表明细胞包膜结构并非决定敏感性的唯一因素，菌株特异的耐酸机制、膜组成、代谢状态和生物膜特性等也可能参与其中。
在抗生物膜效应方面，CFS对生物膜形成的抑制率（66.17%–100%）显著高于对成熟生物膜的破坏率（24.75%–88.11%），提示CFS更擅长于干预生物膜发育的早期阶段。成熟生物膜因EPS屏障和细胞生理异质性而更难被清除，这与既往研究相符。抗生物膜机制还可能涉及对表面黏附、EPS合成、群体感应和毒力相关通路的干扰。
从临床转化角度看，CFS作为局部抗菌策略具有潜力，但仍需进一步开展药代动力学和安全性评估，以及体内模型验证。未来的研究应分别评价乳酸、乙酸及其他CFS代谢物在受控pH条件下的单独及联合作用，并考察局部制剂的安全性、稳定性和可行性。
总体而言，鼠李糖乳杆菌L. rhamnosus ATCC 7469 CFS对A. baumannii和S. aureus具有显著的抗菌和抗生物膜活性，乳酸和乙酸为其重要的有机组成成分；中和后活性显著下降表明酸度和酸相关组分在效应中发挥关键作用，有机酸浓度与生物活性的同步变化进一步支持这一结论。然而，各代谢物的个体贡献尚需明确，未来应在受控条件下系统解析其作用机制，并推进相关制剂的临床前研究。
