裂解性噬菌体UHP46在牛奶、奶酪和酸奶中对金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物防治效果的评价

《Brazilian Journal of Microbiology》：Biocontrol of Staphylococcus aureus in dairy products using lytic bacteriophage UHP46: efficacy in milk, cheese, and yogurt

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是乳制品行业面临的主要公共卫生问题。研究人员指出，S. aureus是公认的牛乳腺炎和原料奶污染病原体；某些菌株能够产生耐热肠毒素，可在人类中引发葡萄球菌性食物中毒。多重耐药S. aureus菌株的出现使得抗生素控制手段已不再有效。本研究测定了裂解性噬菌体UHP46对一株此前已表征的多重耐药乳腺炎分离株——S. aureus S46——在牛奶、奶酪和酸奶三种乳制品基质中，于冷藏储存（4 °C）、常温条件（25 °C）及37 °C机制参考条件下的抗菌活性。在牛奶中，UHP46显著降低了S. aureus S46的菌落数：4 °C条件下4 h和24 h分别降低3.2和3.7 log₁₀ CFU/mL；25 °C条件下4 h和24 h分别降低2.1和3.1 log₁₀ CFU/mL；37 °C条件下3 h降低1.8 log₁₀ CFU/mL。37 °C下的菌落数降低伴随噬菌体效价从7.2升至8.8 log₁₀ PFU/mL。将UHP46应用于奶酪后，室温处理5 min即产生0.6 log₁₀ CFU/g的即时降低；在24 h时观察到最大降幅为2.0 log₁₀ CFU/g，并在4 °C冷藏储存96 h期间维持了1.9 log₁₀ CFU/g的持续降低。在酸奶中，第6天的净降幅在37 °C、25 °C和4 °C下分别为2.8、2.7和1.6 log₁₀ CFU/g。研究结果表明，UHP46在测试的乳制品基质和储存条件下对S. aureus S46表现出显著的抗菌活性。然而，由于所有挑战实验均使用单一宿主菌株，其对更广泛的S. aureus菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA））的有效性仍有待确定。

论文解读文章

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是乳制品行业面临的重大公共卫生挑战。该病原体是牛乳腺炎和原料奶污染的主要诱因，某些菌株可产生热稳定性葡萄球菌肠毒素（SE），即使在细菌载量降至可接受水平后，毒素仍可持续存在，对消费者健康构成持续威胁。多重耐药菌株的出现使抗生素控制失效，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在牛奶中的检出进一步凸显了“One Health”框架下该问题的重要性。传统的控制手段如巴氏杀菌虽能杀灭营养细胞，但无法有效消除已产生的肠毒素，且热处理会改变乳制品中的蛋白质组成，影响风味和质地；化学防腐则因清洁标签偏好而日益受限。噬菌体因其能够特异性裂解宿主细菌而不破坏发酵食品中有益菌群，被认为是补充现有方法的理想生物防治候选。然而，既往研究多局限于单一食品基质和较窄的温度范围，不同基质与储存温度之间的交互作用对噬菌体效能的影响尚未得到充分评估。本研究旨在系统评价裂解性噬菌体UHP46在牛奶、奶酪和酸奶三种乳制品基质中，于冷藏（4 °C）、常温（25 °C）和机制参考（37 °C）三种温度条件下对多重耐药乳腺炎分离株S. aureus S46的抗菌活性，为噬菌体在乳制品生物防治中的应用提供系统数据。

研究人员在牛奶实验中，以1×10⁵ CFU/mL的S. aureus S46接种经热和紫外处理的无菌原料奶，以1×10⁷ PFU/mL的UHP46（感染复数（MOI）约为100）处理，在37 °C下孵育3 h；另在25 °C和4 °C下分别评估24 h内的抑菌效果。奶酪实验中，以约1×10⁵ CFU/g的S. aureus S46均匀接种于市售固体巴氏杀菌奶酪表面，再以1×10⁷ PFU/g的噬菌体处理，4 °C储存96 h，并在5 min、24 h和96 h取样。酸奶实验中，以约2×10³ CFU/g接种市售全脂酸奶，加入噬菌体（MOI=100），于37 °C、25 °C和4 °C储存6天，于第2、4、6天测定活菌数。菌株S46和噬菌体UHP46均来自研究人员此前的研究，菌株分离自巴基斯坦开伯尔-普赫图赫瓦省的乳腺炎牛奶样品。采用双层琼脂法测定噬菌体效价，用甘露醇盐琼脂（MSA）选择平板计数法测定S. aureus活菌数，统计采用双因素方差分析和单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验。

**牛奶中噬菌体UHP46的抗菌活性。**37 °C下孵育3 h，未处理对照组细菌数从5.0增至5.6 log₁₀ CFU/mL，而噬菌体处理组降至3.8 log₁₀ CFU/mL，净降幅为1.8 log₁₀ CFU/mL（p<0.05），伴随噬菌体效价从7.2增至8.8 log₁₀ PFU/mL，表明UHP46在该温度下能主动复制。25 °C下，处理组在4 h和24 h分别较对照降低2.1和3.1 log₁₀ CFU/mL（p<0.05），但处理组细菌数随时间增加，提示存在部分再生长。4 °C下，处理组在4 h和24 h分别降低3.2和3.7 log₁₀ CFU/mL（p<0.05），且24 h内无继发细菌生长，表明低温冷藏条件下噬菌体抑制效果最佳。

**噬菌体UHP46在奶酪中的抗菌效果。**经噬菌体处理5 min，细菌数即从对照组的5.0 log₁₀ CFU/g降至4.4 log₁₀ CFU/g，降低74.9%（0.6 log₁₀）；24 h后降幅显著增至99.0%（2.0 log₁₀，p<0.001），对照和处理组分别为5.8和3.8 log₁₀ CFU/g；96 h时处理组仍维持4.3 log₁₀ CFU/g，较对照（6.2 log₁₀ CFU/g）降低98.7%（p<0.01）。两组在4 °C储存期间均呈现再生长趋势，但处理组始终显著低于对照组。

**UHP46在不同储存温度下对酸奶的抗菌活性。**37 °C下，对照组细菌计数从第2天的5.2±0.2 log₁₀ CFU/g增至第6天的6.6±0.2 log₁₀ CFU/g，而处理组维持在3.4至3.8 log₁₀ CFU/g之间（p<0.001）；25 °C下呈现类似模式，处理组维持在2.8至3.1 log₁₀ CFU/g（p<0.001）；4 °C下两组生长均受抑制，但处理组在第4天降至最低2.5±0.2 log₁₀ CFU/g（p<0.01）。第6天净降幅分别为37 °C 2.8、25 °C 2.7和4 °C 1.6 log₁₀ CFU/g。

**储存温度对噬菌体效果的影响。**以单因素方差分析和Tukey检验比较酸奶中三种温度下的log₁₀降幅，总体温度效应不显著（F(2,6)=3.692，p=0.0901），37 °C与25 °C、37 °C与4 °C、25 °C与4 °C两两比较均无显著差异。不过，4 °C下处理组的残留活菌数最低（2.7 log₁₀ CFU/g），说明净降幅与绝对终点负荷是不同概念——净降幅受未处理对照的同步生长影响。跨基质比较需注意酸奶初始接种量（约2×10³ CFU/g）低于牛奶和奶酪（均约1×10⁵ CFU/mL或CFU/g），因此不宜直接比较不同基质的降幅。

讨论部分指出，UHP46在37 °C牛奶中的快速复制与该噬菌体此前测定的短潜伏期（约20 min）和裂解量（27±1 PFU/细胞）一致。低温下噬菌体效果更佳与宿主菌增殖受限有关，这与Fister等报道的噬菌体在限制细菌繁殖条件下效能增强的结论相符。奶酪中从5 min到24 h抗菌效果逐步提升，可能与噬菌体在固体基质中需要更长时间完成吸附和扩散有关。与文献中噬菌体鸡尾酒在硬质奶酪中实现的4.64 log₁₀ CFU/g降幅相比，UHP46单一噬菌体的降幅较低，这与菌株差异、噬菌体类型、奶酪种类和施用剂量不同有关。酸奶中的活性在6天内持续存在，但本研究未测定酸奶的pH值，酸性基质对噬菌体稳定性的影响尚无法直接解读。UHP46此前基因组分析未携带抗生素抗性基因、已知毒力因子或溶原相关元件，且宿主范围较窄（29株乳腺炎S. aureus分离株中仅裂解4株，即13.8%），提示其对非靶标微生物（包括发酵剂菌株）影响有限，但仍需进一步验证。研究局限性还包括仅使用单一宿主菌株开展挑战实验，且未评估感官影响。讨论强调，规模化生产和监管审批是在巴基斯坦等缺乏专门噬菌体法规框架的市场中进行商业化应用的主要障碍，未来方向包括噬菌体组合策略、扩展菌株谱系评估及商业化条件下的效能验证。

**研究结论。**噬菌体UHP46在牛奶、奶酪和酸奶等测试乳制品基质中，于不同储存温度下均表现出对S. aureus S46的强烈抑制作用。这种天然来源的生物防治剂展现了不依赖抗生素进行乳制品应用评估的潜力。如先前报道所述，UHP46的基因组特征未显示抗生素耐药基因、已知毒力因子或与溶原相关的DNA区域，表明其安全性符合严格裂解性噬菌体生物学特征。本研究评估的是抗菌效能而非安全性，但商业应用前仍需更多的监管级表征。未来需要进一步研究UHP46作为噬菌体鸡尾酒的效力，评估其对不同S. aureus菌株和不同MRSA分离株的效果，以及在商业加工条件下的表现。