《Frontiers in Pharmacology》：Integrated network toxicology and multi-omics profiling reveal cell cycle, DNA damage repair, and metabolic alterations in cyclophosphamide-induced premature ovarian insufficiency
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背景： 环磷酰胺（Cyclophosphamide, CTX）诱导的化疗损伤是医源性早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency, POI）的首要原因，亦是生育力保存的重大障碍。然而，其生殖毒性的系统层面机制仍未被充分阐明
背景： 环磷酰胺（Cyclophosphamide, CTX）诱导的化疗损伤是医源性早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency, POI）的首要原因，亦是生育力保存的重大障碍。然而，其生殖毒性的系统层面机制仍未被充分阐明。
方法： 研究人员构建了一个整合机器学习与孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）的网络毒理学框架，用于识别候选靶点、评估遗传关联并建立预测模型。随后，在CTX诱导的POI大鼠模型中开展了卵巢转录组学与代谢组学分析，并进行了体内验证。进一步通过基于单细胞的计算机模拟扰动分析，探究关键候选靶点在POI中潜在的细胞功能与作用机制。
结果： 整合生物信息学分析与机器学习优先筛选出六个与CTX诱导卵巢损伤相关的候选靶点，其中偏最小二乘（Partial Least Squares, PLS）回归被一致认定为最优预测模型。SHAP分析揭示CXCL1与COL4A4是模型预测的主要贡献因子。MR分析支持遗传预测的CXCL1/COL4A4表达与POI风险之间存在遗传关联。免疫组织化学验证确认了蛋白表达模式与转录组学结果的一致性。多组学分析揭示了一个趋同的卵巢损伤特征，表现为细胞周期调控（G2/M检查点）受损、DNA损伤修复与有丝分裂功能（有丝分裂纺锤体）缺陷、凋亡信号增强，以及叶酸代谢、泛醌生物合成和细胞色素P450介导的药物代谢通路的协同抑制。基于单细胞的计算机模拟扰动分析进一步提示，CXCL1与COL4A4可能通过调控炎症反应与细胞外基质重塑参与卵巢功能障碍。
结论： 本研究表明，CTX诱导的卵巢损伤伴随免疫炎症信号、细胞周期与DNA损伤反应及代谢稳态的协同改变。CXCL1与COL4A4被优先确定为与POI风险相关的候选生物标志物，为后续机制研究及生育力保护干预提供了潜在靶点。
研究背景与问题提出
早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency, POI）是以卵泡耗竭、促性腺激素升高和低雌激素为特征的生殖内分泌疾病，临床表现为月经紊乱、不孕及围绝经期症状。持续的雌激素缺乏显著增加心血管疾病、骨质疏松和神经退行性疾病等远期共病风险。POI病因具有异质性，其中化疗相关卵巢损伤是最常见且临床意义重大的医源性病因之一。化疗药物可触发卵泡丢失和颗粒细胞凋亡，破坏卵巢微环境稳态，进而损害细胞间代谢支持与信号串扰，加速卵巢功能衰退。随着癌症生存率提高及育龄期女性幸存者群体扩大，治疗诱导的卵巢损伤已成为生育力保存和长期生殖健康的重大障碍。环磷酰胺（Cyclophosphamide, CTX）是经典烷化剂，广泛用于恶性肿瘤和自身免疫病治疗，但其对女性及男性生殖均有不良影响。CTX经肝脏代谢为高反应性中间体4-羟基环磷酰胺，可诱导DNA交联和双链断裂、增强氧化应激、破坏线粒体膜电位并促进卵巢组织脂质过氧化。然而，现有研究多聚焦于单一分子或孤立信号通路，缺乏系统层面的毒理学框架。网络毒理学可系统解析化学物诱导毒性的多靶点相互作用和通路扰动，多组学方法则提供复杂系统内生物活动的多维视角。因此，研究人员以CTX为模型化合物，整合网络毒理学、机器学习（Machine Learning, ML）和孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）策略优先筛选毒性相关靶点并建立预测模型，同时开展POI大鼠模型卵巢转录组与代谢组分析，并进行关键靶点的体内验证及单细胞计算机模拟扰动分析，旨在构建CTX诱导化疗相关卵巢损伤的系统毒理学网络，为生育力保护和靶向干预提供机制依据和可行靶点。
主要技术方法
研究人员从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取POI相关转录组数据集GSE201276和GSE296744，经批次效应校正后鉴定差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。CTX相关基因从ChEMBL、GeneCards、PharmMapper和SwissTargetPrediction四个数据库整合获取。采用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）识别与POI表型显著相关的共表达模块及枢纽基因。通过LASSO回归筛选候选关键靶点。建立CTX诱导的POI大鼠模型（Sprague–Dawley大鼠，每组6只），采用纳米孔全长转录组测序和液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC–QTOF）非靶向代谢组学分析。运用17种机器学习算法构建并验证诊断模型，以受试者工作特征曲线下面积（Area Under the ROC Curve, AUC）评估性能，采用SHAP分析进行模型可解释性分析。构建转录因子-微小RNA-信使RNA调控网络。利用eQTLGen和FinnGen数据进行MR分析。对卵巢单细胞数据集GSE334364进行细胞注释，并采用scTenifoldKnk进行基于单细胞的计算机模拟扰动分析。
研究结果
POI相关差异基因与CTX相关靶点的鉴定： 经批次效应校正后，共鉴定844个POI相关DEGs，其中330个上调、514个下调。从四个数据库整合去重后获得2657个CTX相关基因作为初始候选池。
WGCNA关键模块与枢纽基因识别： WGCNA确定最优软阈值为4，检测到36个共表达模块，其中5个模块与POI表型显著相关（|R| > 0.3, P < 0.05），鉴定出1115个枢纽基因。DEGs、WGCNA枢纽基因与CTX相关靶点的交集最终获得50个候选基因。
交集基因GO与KEGG富集分析： KEGG富集显示交集基因主要富集于孕酮介导的卵母细胞成熟、细胞黏附分子、卵母细胞减数分裂、细胞周期、谷胱甘肽代谢及精氨酸和脯氨酸代谢等通路。GO分析显示富集于染色体分离、姐妹染色单体分离、有丝分裂细胞周期相变等生物学过程，以及激酶调节活性、氧化还原酶活性、谷胱甘肽转移酶活性等分子功能。
LASSO回归筛选候选生物标志物基因： 在最优惩罚参数λ = 0.15557下，SORD、COL4A4、CXCL1、DUSP1、HMGCR和SERPINE2六个基因保留在模型中，作为候选生物标志物。
多分类模型确定最优诊断模型： 17种机器学习分类器中，PLS模型表现最佳，训练集AUC为0.959，验证集AUC为0.889，平均AUC为0.924，最终保留SORD、COL4A4、CXCL1、DUSP1和SERPINE2五个关键特征基因作为诊断组合。校准曲线、决策曲线分析和精确率-召回率曲线均支持PLS模型的临床效用和稳健性。
SHAP模型可解释性分析： SHAP分析显示CXCL1是模型预测的最强贡献因子，其次为COL4A4。CXCL1和COL4A4高表达样本主要聚集在正向SHAP侧，提示其高表达驱动模型预测CTX诱导卵巢损伤；SORD高表达则主要分布在负向SHAP侧，提示保护性作用。
MR分析揭示CXCL1和COL4A4与POI风险的遗传关联： 五种MR方法一致显示CXCL1/COL4A4表达与POI风险存在正向遗传关联，漏斗图呈近似对称分布，未发现显著定向多效性证据。
CTX诱导POI大鼠模型的建立： POI组大鼠体重和卵巢重量显著降低，动情周期紊乱，血清FSH显著升高而E2和AMH显著降低，HE染色显示各发育阶段有腔卵泡数量显著减少、闭锁卵泡增加，提示POI模型成功建立。
CTX诱导卵巢损伤的转录组特征： 全长转录组测序鉴定2065个DEGs（1099个上调、966个下调）。KEGG富集显示DEGs主要参与卵巢类固醇生成、TNF信号、类固醇生物合成及细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）显示POI样本中凋亡、雌激素反应晚期和脂肪酸代谢通路显著正富集。
CXCL1和COL4A4的免疫组化验证： 免疫组化显示CXCL1蛋白在POI大鼠卵巢中显著升高，主要分布于颗粒细胞和间质区；COL4A4表达呈下降趋势但未达统计学显著。蛋白表达模式与转录组结果基本一致。
转录组与GEO数据集的GSVA分析： 基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）显示POI组在有丝分裂纺锤体、G2M检查点、MYC靶点V1、DNA修复等细胞周期和增殖相关通路呈全局负富集，同时脂肪酸代谢、脂肪生成、胆固醇稳态、胆汁酸代谢等代谢通路显著重编程。两个数据集均一致显示有丝分裂纺锤体和G2M检查点通路下调，提示细胞周期阻滞和有丝分裂功能障碍是化疗诱导POI的核心病理机制。
单细胞转录组分析鉴定卵巢细胞群体： 单细胞分析鉴定出14个细胞簇，注释为颗粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、黄体细胞、基质细胞和膜细胞七大类卵巢细胞群体。
Cxcl1和Col4a4的单细胞表达谱及计算机模拟扰动分析： Cxcl1主要表达于颗粒细胞和膜细胞，Col4a4富集于颗粒细胞并在巨噬细胞和膜细胞中可检测。计算机模拟扰动分析显示，Cxcl1虚拟扰动影响21个显著基因，主要富集于TNF信号、NF-κB信号、MAPK信号和凋亡等炎症免疫相关通路；Col4a4虚拟扰动影响32个显著基因，功能富集突出整合素信号、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）-受体相互作用、细胞黏附和细胞骨架调节等通路。
CTX诱导化疗相关卵巢损伤的代谢组特征： OPLS-DA显示对照组与POI组显著分离，鉴定162个显著差异代谢物（51个上调、111个下调）。KEGG富集显示差异代谢物主要参与抗叶酸耐药、嘧啶代谢、NOD样受体信号、维生素消化吸收、泛醌及其他萜类醌生物合成、细胞色素P450介导的药物代谢等通路。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次整合网络毒理学、转录组学与代谢组学，结合机器学习和MR系统鉴定CTX诱导POI的生物标志物并阐明分子机制。CXCL1作为关键趋化因子，在化疗相关组织损伤中可能通过早期趋化因子诱导-免疫细胞募集-炎症放大级联发挥作用，并通过调节衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）参与细胞衰老。CTX诱导的DNA损伤和细胞应激可能增强CXCL1表达，其与受体CXCR2结合促进中性粒细胞浸润和中性粒细胞胞外陷阱形成，通过增加活性氧产生和凋亡信号加剧卵巢细胞损伤。COL4A4编码IV型胶原α4链，是基底膜的重要结构成分，除结构作用外还通过整合素受体参与细胞增殖、迁移和存活调节及雌激素受体表达调控。转录组分析显示细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号通路显著富集，提示POI卵巢局部炎症和免疫相关通路显著激活。GSVA分析一致显示有丝分裂纺锤体和G2M检查点通路抑制，提示CTX诱导卵巢损伤以细胞周期阻滞、有丝分裂进程受损和DNA损伤反应失调为特征。代谢组分析显示抗叶酸耐药通路下调提示叶酸依赖性一碳代谢和核苷酸生物合成受损，可能限制DNA合成和修复能力；泛醌生物合成抑制提示辅酶Q10可用性降低，涉及线粒体功能障碍和氧化还原稳态受损；细胞色素P450介导的药物代谢通路下调提示卵巢解毒能力下降，可能延长CTX及其反应性代谢物的局部暴露。研究也存在局限性：大鼠模型CTX方案不能完全重现临床给药方案；CXCL1和COL4A4的功能作用尚待通过敲低和过表达实验确立；转录组和代谢组发现目前仅显示并发改变而非因果机制。
结论部分总结：本研究应用整合网络毒理学和多组学策略，结合机器学习和遗传分析，表征了与CTX诱导卵巢毒性相关的候选生物标志物和分子改变。PLS模型显示出稳健的预测性能，CXCL1和COL4A4被优先确定为模型判别的主要贡献因子。转录组分析揭示细胞周期相关通路（包括G2M检查点和有丝分裂纺锤体）抑制，伴随炎症和凋亡信号激活，与DNA损伤反应紊乱和卵巢细胞稳态受损一致。代谢组分析进一步鉴定叶酸代谢、泛醌生物合成和细胞色素P450介导的药物代谢的协同改变，提示线粒体功能、核苷酸代谢和氧化还原平衡紊乱。此外，基于单细胞的计算机模拟扰动分析提示CXCL1和COL4A4可能通过调控炎症反应和细胞外基质重塑参与卵巢功能障碍。综上，CTX诱导的卵巢损伤涉及免疫炎症、DNA损伤反应和代谢改变的相互关联，为化疗相关卵巢功能障碍和生育力保护提供了潜在分子见解。
