基于增强型Split Intein介导连接（SIML）平台的环状细菌素快速发现与功能筛选

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：An enhanced split intein-mediated ligation (SIML) platform for rapid discovery and functional screening of circular bacteriocins

　　

细菌素是由核糖体合成的抗菌肽，在生物技术领域具有广阔应用前景，尤其在食品保藏以及动物和人类健康方面。环状细菌素因其头尾环化结构尤为引人注目，该结构使其相较于线性肽具有更强的稳定性和抗菌效力。本文报道了一种将体外无细胞蛋白质合成系统与增强型Split Intein介导连接平台（IV-CFPS/SIML）偶联的方法，通过对环化位点和替代性split intein的系统评估，实现环状细菌素的高效合成。以肠球菌素AS-48为模型，研究人员系统评估了多个基于丝氨酸的环化位点与三种split intein（NpuDnaE、Gp41-1和SspGyrB）的组合，以鉴定产生高抗菌活性的构型。Gp41-1被证实为最有效的intein，并随后被应用于garvicin ML、amylocyclicin及27种天然序列变体的生产，表明环化位点选择、intein身份以及微小序列变异对抗菌效力和靶标范围具有强烈影响。最后，编码于pUC衍生载体中的SIML表达盒实现了所选环状细菌素在重组大肠杆菌中的体内生产和功能性表达。综上，这些结果确立了SIML作为一个多功能平台，可用于已知和推定环状细菌素的体外和体内生产、筛选及功能表征。

环状细菌素因其头尾环化结构而具有优异的稳定性和抗菌活性，是应对抗生素耐药性危机的重要候选抗菌剂。然而，其天然生物合成途径复杂，涉及前体肽加工、环化、转运、调控及免疫等多个基因簇编码蛋白，导致传统活性导向纯化和异源表达策略耗时费力，严重制约了环状细菌素的快速发现与功能筛选。为突破这一瓶颈，研究人员在前期工作中建立了基于split intein介导连接的SIML平台，利用NpuDnaE split intein可在体外和体内实现环状细菌素的头尾环化，无需额外生物合成基因。然而，环化位点的选择及不同split intein的特性对环状细菌素生产效率与抗菌活性的影响尚未被系统研究，且NpuDnaE天然偏向半胱氨酸作为+1亲核残基，而环状细菌素通常缺乏半胱氨酸，这可能导致环化效率受限。因此，本研究旨在系统评估环化位点与split intein身份对IV-CFPS/SIML平台功能输出的影响，并拓展该平台在环状细菌素变体快速筛选及体内生产中的应用。

研究人员以肠球菌素AS-48（EntAS-48）为模型，选取其四个内部丝氨酸残基（S30、S37、S41和S50）作为+1亲核残基，分别与NpuDnaE、Gp41-1和SspGyrB三种split intein组合，通过IV-CFPS/SIML平台合成环状EntAS-48，并利用spot-on-agar法和微量板法测定其对片球菌Pediococcus damnosus CECT 4797的抗菌活性。结果表明，环化位点和intein身份均显著影响抗菌活性：Gp41-1-EntAS48_S41组合活性最高，达1.75 × 10⁷ BU，比最低活性组合（SspGyrB-EntAS48_S30，3.2 × 10² BU）高出五个数量级；NpuDnaE介导的S41环化产物活性为2.18 × 10⁶ BU。随后，研究人员将优化的Gp41-1 intein应用于garvicin ML（GarML）和amylocyclicin（AmCyc）的生产，发现GarML对环化位点变化相对耐受（S19、S29、S32均有一定活性），而AmCyc则严格依赖S23位点，仅该构型显示高活性（稀释1:8192），其他位点活性极低。此外，研究人员利用BLASTp分析鉴定了27种天然序列变体（EntAS-48来源9种、GarML来源4种、AmCyc来源11种），在Gp41-1 intein和保守丝氨酸环化位点（S41、S29、S23）条件下通过IV-CFPS/SIML合成并测试了其对多种革兰氏阳性和阴性指示菌的抗菌谱。结果显示，变体间抗菌活性和靶标范围差异显著：AS48_1和AS48_2谱最广，可抑制片球菌、乳球菌、肠球菌、单增李斯特菌、链球菌、芽孢杆菌、丹毒丝菌、幼虫芽孢杆菌和产气荚膜梭菌；AmCyc变体功能多样性最高，其中ACC_1和ACC_3甚至抑制大肠杆菌；ACC_12无活性。值得关注的是，ACC_11源自西伯利亚永久冻土猛犸象肠道分离的Kurthia sibirica基因组，其成功表达验证了SIML平台可从极端甚至灭绝生态位中恢复功能性环状细菌素。最后，研究人员将编码AS48_1（S41）和ACC_3（S23）的SIML表达盒克隆至pUC衍生载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内生产，经疏水相互作用层析和反相快速蛋白液相色谱纯化后，MALDI-TOF质谱测得AS48_1分子量为7149.45 Da，ACC_3为6352.64 Da，均比线性前体低约18 Da，证实了头尾环化发生。

本研究系统揭示了环化位点选择和split intein身份是决定IV-CFPS/SIML平台功能输出的关键参数，强调序列基序之外的更高阶结构环境对intein剪接效率的重要影响。Gp41-1因其天然适应丝氨酸+1亲核残基和超快剪接动力学，成为环状细菌素生产的最优intein。研究成功将优化条件扩展至27种天然变体的快速功能筛选，极大拓展了环状细菌素的已知多样性，包括来自极端环境或难以培养微生物的推定环状细菌素。此外，IV-CFPS/SIML优化设计可直接转化为重组大肠杆菌中的体内生产，证明了该平台的模块化和可扩展性。综上，SIML平台为环状细菌素的体外/体内生产、筛选和工程改造提供了快速、通用且可规模化的工具，为新型抗菌肽开发奠定了基础。

研究结论：抗生素耐药病原体的加速出现凸显了对能够快速发现、验证和工程改造新型抗菌剂的合成生物学平台的迫切需求。环状细菌素因其优异的结构稳定性和强效抗菌活性而备受关注，但天然生物合成途径的复杂性限制了其深入开发和异源生产。本文提出了一种将体外无细胞蛋白质合成与Split Intein介导连接（IV-CFPS/SIML）相结合的多功能合成生物学框架，无需额外基因簇编码蛋白即可实现成熟环状细菌素的高效生产、头尾环化和功能表达。系统评估表明，环化位点选择和split intein身份均强烈影响肠球菌素AS-48、garvicin ML和amylocyclicin的抗菌活性，特定环化位点–intein组合产生显著差异的活性。这些条件成功实现了27种天然细菌素变体的功能生产，揭示了抗菌效力和靶标范围的显著多样性，并证明微小序列变异即可显著改变生物活性。此外，将SIML构建体转移至pUC衍生载体可实现所选细菌素在重组大肠杆菌中的体内生产、环化和功能表达，证明了优化设计可直接转化至细胞系统。综上，SIML是一个快速、模块化且可扩展的体外和体内环状细菌素生产、筛选和工程改造平台，凸显了split intein介导环化作为扩展抗菌肽多样性和指导下一代肽设计的强大策略。