相干拉曼散射显微镜用于纵向活细胞化学成像：检测限、化学选择性与光毒性

《Analyst》：Longitudinal live-cell chemical imaging using coherent Raman scattering microscopyOpen Access

　　

光学方法能够以微创方式分析生物样本中的化学分布和动力学。许多光学成像模式已被开发出来，基于内在分子特征或高度特异性标记产生化学对比度。相干拉曼散射（Coherent Raman scattering, CRS）显微镜已成为对生物样本中的生物分子或外源性化合物进行成像的强大无标记技术。大多数CRS成像研究侧重于提取样本中的化学分布、组成和丰度，这些领域的工作已被广泛综述。然而，化学过程的一个重要方面——化学变化随时间的动力学——在CRS显微镜中受到的关注较少。许多关于化学过程的关键见解在于活体样本中分子种类的时空演化。这种信息只能通过活细胞成像获得，更重要的是，需要对同一标本进行随时间推移的纵向成像。在这篇综述中，研究人员重点关注与纵向活细胞CRS显微镜相关的关键参数以及近期主要研究。研究人员首先讨论了纵向CRS成像必须考虑的三个主要因素：检测限（Limit of Detection, LOD）、化学选择性和光毒性。检测限和化学选择性决定CRS能够测量什么，而光毒性则决定纵向成像能否以对生物功能的最小扰动捕捉有意义的细胞化学动力学。在这些讨论中，研究人员还对CRS显微镜和荧光显微镜进行了批判性比较。然后，研究人员回顾了纵向CRS显微镜的最新发展和成就。最后，研究人员对未来方向以及纵向CRS显微镜可以为促进我们对生物过程的理解做出贡献的领域提供了展望。

1. Introduction
该部分指出生物体是分子的复杂组装体，获取活体中的化学信息对理解生命机制和疾病转变至关重要。光学成像具有微创性和高空间分辨率，适用于活细胞分析。活细胞是高度动态的系统，静态图像无法揭示时间变化，因此需要纵向成像。荧光显微镜是最广泛使用的化学成像技术，但存在标记需求、光漂白和光毒性等限制。无标记振动成像，特别是相干拉曼散射（CRS）显微镜，能够利用分子振动特征实现高速成像，适合活细胞研究。本综述聚焦纵向活细胞CRS成像的关键参数和进展。

2. Limit of detection of CRS microscopy
CRS的检测限（LOD）通常远高于（即差于）荧光显微镜，根本原因是电子吸收截面比拉曼散射截面大10¹²–10¹⁴倍。CRS虽然抑制了荧光背景，但存在非共振背景（CARS）、瞬态吸收（SRS）和水背景等。实际LOD一般在水环境中为毫摩尔至微摩尔量级（如C–H键），而荧光技术可达纳摩尔至飞摩尔甚至单分子检测。通过拉曼标签可改善LOD，但仍无法与荧光相比。

3. Chemical selectivity of CRS microscopy
CRS的化学选择性来自分子振动特征，对小分子如中性脂质、药物、维生素A等有效。脂滴因富含CH₂产生强信号，高光谱CRS可区分其组成。对于大分子如蛋白质和DNA，只能提供总浓度信息。相比之下，荧光显微镜通过抗体、基因编码荧光蛋白、核酸探针等策略实现高度的分子特异性，并可检测代谢物和离子。拉曼标签（如炔基、氰基）可增强选择性，但LOD仍较差，且难以遗传编码。

4. Phototoxicity and photoperturbation in longitudinal CRS microscopy
4.1 Mechanisms of phototoxicity and photoperturbation
光毒性主要源于活性氧（ROS）生成，涉及三线态敏化、多光子吸收、电离和热效应等。荧光染料和蛋白质可能产生ROS，损伤脂质、蛋白质和DNA。CRS使用近红外脉冲激光，非线性吸收是主要光损伤途径，极端条件下可发生多光子电离和等离子体。

4.2 Phototoxicity and photoperturbation in CRS microscopy
CRS中的光损伤包括光化学、光热和光机械效应。近红外激发下多光子吸收占主导，高峰值功率可导致电离和烧蚀。可见光脉冲的毒性更高，应避免。

4.3 Photodamage and signal-to-noise ratio
安全成像需在SNR=3的检测限与损伤阈值（DT）之间运行。不同光学过程的SNR与激光功率关系不同。系统优化可提高SNR并降低光毒性。荧光标记、短波长和氧气会降低DT，间歇照明可提高DT。

4.4 Signal-to-perturbation ratio
该文建立了信号-扰动比（SPR）框架，定义信号与光扰动能量的比值。对于CARS和SRS，SPR与激光参数（功率、重复频率、脉冲宽度、聚焦尺寸）及分子性质（拉曼截面、双光子吸收截面）有关。

4.4.1 CRS signals
CARS和SRS的单像素信号与激光功率、脉冲参数、分子浓度等相关，信号强度依赖于泵浦和斯托克斯光的功率及聚焦体积。

4.4.2 Optical perturbation at each pixel using pulsed lasers
脉冲激光的光扰动由多光子吸收主导，总扰动能量与峰值功率和平均功率相关，并可用广义表达式描述不同阶数的多光子过程。

4.4.3 An example of two-photon absorption-associated triplet-state perturbation
以双光子吸收导致的三线态转换为例，给出了光扰动能量的定量表达式，说明其与分子密度、双光子吸收截面和激光参数的关系。

4.4.4 Signal-to-perturbation ratio
定义SPR为信号与光扰动之比。推导得到CARS的SPR与分子浓度平方和拉曼响应成正比，SRS的SPR与浓度线性相关；SRS的SPR不依赖于激光重复率和脉冲宽度。

4.4.5 Laser configurations
通量标度因子ξ=1/(Afτ)决定多光子扰动。在不同非线性阶数下，SPR对ξ的依赖不同。泵浦与斯托克斯功率最优比：CARS为2:1，SRS为1:1。

4.4.6 Linear absorption using CW lasers
连续激光激发下，SPR主要由荧光量子产率与三线态转换效率的比值决定。

4.4.7 Optical perturbation for live cells
实际光扰动需考虑细胞大小和细胞器差异；含强吸收体的区域（如线粒体）易受更严重扰动，且相同扰动在不同细胞器中可能产生不同的生物学后果。

4.5 Metrics to evaluate phototoxicity in optical microscopy
评估指标包括形态学变化、化学过程变化、氧化应激定量和增殖能力，能反映从严重到轻微的光损伤。

4.5.1 Morphological indicators of photoperturbations
形态学变化如气泡形成、膜出泡、细胞皱缩和脱落是严重光损伤的标志，但在轻微扰动时可能不显著。

4.5.2 Changes in chemical processes as readouts
生物质合成、脂滴动力学、细胞器运动、细胞色素c释放等化学过程变化可敏感反映光扰动，适合作为纵向成像中的毒性指标。

4.5.3 Oxidative stress quantification
利用ROS敏感荧光探针或基因编码传感器可直接定量氧化应激；结合转录组分析可揭示激光暴露导致的应激基因上调。

4.5.4 Proliferation capability
细胞增殖率是评估长期光毒性的重要指标，细胞分裂对扰动高度敏感，可用于检测亚致死损伤和衰老。

4.6 Common laser parameters for CRS microscopy
近红外皮秒脉冲（如80 MHz重复率、数毫瓦至数十毫瓦平均功率）常用于活细胞CRS成像。降低重复频率、展宽脉冲宽度或采用脉冲啁啾可减少非线性光损伤，应避免使用可见光激发及水吸收带（~1450 nm）。

5. Longitudinal live-cell CRS microscopy
5.1 Temporal sampling across parallel cell populations
许多研究采用在不同时间点对平行细胞群体成像的方式，通过统计比较推断时间变化。此方法简单，但无法追踪同一细胞的动态轨迹。

5.2 Longitudinal live-cell imaging
真正的纵向成像需要维持细胞环境（温度、湿度、CO₂等）并保持焦平面稳定。常见配置包括将细胞返回培养箱、使用载物台培养箱或微流控芯片。CARS可用于监测脂滴降解、细胞粘附等；SRS用于追踪药物摄取、细菌代谢等。微流控平台可实现药物处理和实时成像。

6. Future perspectives
纵向CRS成像的应用受限于检测限和化学选择性，最适合检测高丰度脂质、药物等。高光谱和多通道方法需要提高速度并减少光毒性。3D培养和活体生物成像面临穿透深度挑战。结合光遗传等空间扰动方法可研究局部刺激的细胞响应。自动对焦和多视场稳定技术将推动发展。

7. Conclusions
本综述讨论了纵向活细胞CRS成像的检测限、化学选择性和光毒性，综述了最新应用，并展望了未来方向。提高环境控制和理解光损伤机制将有助于发挥CRS在动态细胞化学研究中的潜力。