《Analyst》：Antioxidant suppression of hyperoxia-induced reactive oxygen species in cultured rat hippocampal neuronsOpen Access
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中枢神经系统氧中毒（central nervous system oxygen toxicity，CNS-OT）部分由高氧暴露期间产生的过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）驱动。在此，研究人员开发了一个使用胚胎大鼠海马神经元的体
中枢神经系统氧中毒（central nervous system oxygen toxicity，CNS-OT）部分由高氧暴露期间产生的过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）驱动。在此，研究人员开发了一个使用胚胎大鼠海马神经元的体外筛选平台，在高氧应激（1.34 ATA）下评估候选抗氧化剂，并通过二氢罗丹明123（dihydrorhodamine，DHR）荧光成像和流式细胞术定量ROS。在整个测定过程中，神经元培养物保持存活，抗βIII微管蛋白染色效率约为87%，与神经突生长相关的存活率约为88%。在所测试的化合物中，在15分钟高氧暴露后，硫莱菔子素（sulforaphane）和硫氧还蛋白（thioredoxin）在1 μM浓度下使ROS阳性神经元的减少幅度最大，分别减少了53.3%和54.2%。胸腺醌（thymoquinone）在0.1 μM浓度下显示出最大的ROS产生减少，约减少48%，而在1 μM浓度下其效果减弱，表明在所测试的浓度范围内存在非单调响应。在30分钟高氧暴露后，所有化合物的保护作用均减弱。药物组合处理导致ROS抑制效果略有改善，减少范围在12.8%至17.3%之间。这些发现表明，所提出的体外平台能够在受控的高氧条件下可靠地区分抗氧化功效，并可作为中枢神经系统氧中毒神经保护疗法临床前筛选和优化的实用工具。
研究背景与目的
中枢神经系统氧中毒（central nervous system oxygen toxicity，CNS-OT）是军事潜水员在使用闭路氧气循环呼吸器进行深潜作业时面临的主要风险之一。在高压环境下呼吸高浓度氧气，即使在较浅深度也会显著增加氧中毒的风险。在细胞层面，正常情况下机体的氧化还原系统维持着活性氧（reactive oxygen species，ROS）等活性分子的平衡。然而，当线粒体功能障碍或高氧暴露导致ROS过量产生，超过细胞自身的抗氧化防御能力时，便会引发氧化应激状态，进而损伤脂质、蛋白质和DNA，最终导致中枢神经系统损伤。尽管已有文献支持维生素C、α-生育酚等抗氧化剂的益处，但仍需一个简便可靠的体外平台来系统筛选和优化针对CNS-OT的神经保护候选药物。为此，研究人员利用胚胎大鼠海马神经元建立了高氧暴露模型，旨在评估不同抗氧化剂的ROS抑制效果。
主要技术方法
研究人员构建了一个低成本的DIY高氧舱，连接99%氧气钢瓶，将培养于96孔板中的大鼠海马神经元置于1.34 ATA压力下进行15或30分钟的高氧暴露。采用二氢罗丹明123（DHR）荧光染料作为ROS指示剂，结合荧光显微镜成像和Attune NXT流式细胞仪进行定性和定量检测。同时，利用抗βIII微管蛋白免疫荧光染色和神经突生长染色试剂盒评估神经元活力和形态完整性，并使用自定义Python算法进行图像分析。
研究结果
3.1 活力测定：通过抗βIII微管蛋白染色和流式细胞术确认，培养的神经元具有约87%的染色效率和良好的结构完整性。神经突生长染色进一步证实了约88%的细胞具有活跃的神经突延伸和网络形成能力，表明神经元具备用于后续实验的良好活力基础。
3.1.1 测定各阶段的神经元健康状态：在正式氧化应激实验前，研究人员评估了24小时预孵育候选药物对神经元活力的影响。结果显示，未经处理的基线对照细胞活力为88%；经1.34 ATA高氧暴露15分钟后，细胞仍保持87%的活力；而分别用1 μM硫莱菔子素（sulforaphane）、1 μM硫氧还蛋白（thioredoxin）和0.1 μM胸腺醌（thymoquinone）预处理24小时的神经元，其活力均维持在较高水平（分别为88%、91%和较高活力），证明这些药物本身不会对细胞造成毒性。
3.2 各种药物的ROS抑制活性：研究人员利用DHR荧光探针检测细胞内ROS水平。在15分钟高氧暴露下，未加药的阳性对照组显示强烈的绿色荧光信号。随着药物浓度的增加，荧光信号逐渐减弱。
3.2.1 硫莱菔子素的活性：硫莱菔子素呈剂量依赖性降低ROS。在0.1 nM、1 nM、0.1 μM和1 μM浓度下，ROS阳性神经元的比例分别降低了10.9%、23.3%、37.8%和53.3%。这归因于其通过细胞膜被动扩散，激活Nrf2/Keap1通路，上调下游抗氧化酶的表达。
3.2.2 硫氧还蛋白的活性：虽然外源性硫氧还蛋白不易进入细胞，但研究表明其可通过脂筏等方式被摄取。在0.1 nM至1 μM的浓度范围内，硫氧还蛋白表现出强大的ROS清除能力，ROS抑制率从39.2%逐步上升至54.2%，即使在最低浓度也显示出近40%的效果。
3.2.3 药物组合的比较分析：综合比较三种药物，硫氧还蛋白在低浓度（0.1 nM）即有效（约40%），硫莱菔子素在高浓度（1 μM）效果最佳（约54%）。胸腺醌则表现出非单调响应，在0.1 μM达到峰值（约48%），但在1 μM时效果下降至约32%，这可能与其在高浓度下从抗氧化转变为促氧化特性有关。单因素方差分析（ANOVA）显示，所有三种药物在不同浓度间的ROS降低效应均存在显著差异（p < 0.05）。
3.2.4 更长暴露时间下的ROS降低活性：当高氧暴露延长至30分钟时，低浓度药物的保护作用大幅减弱（如1 μM硫莱菔子素的ROS抑制率降至1.88%）。提高药物浓度至5 μM或10 μM可部分恢复抑制效果（硫莱菔子素20.7%，硫氧还蛋白18.7%）。此外，药物组合（如1 μM硫莱菔子素联合0.1 μM胸腺醌）在长时间暴露下仅带来12.8%至17.3%的适度改善，表明长时间高强度氧化应激需要更高浓度的干预。
结论总结
研究人员成功建立了一个简便、易行的体外平台，用于在可控高氧条件下评估氧化应激和筛选潜在的神经保护化合物。该平台结合了低成本DIY高氧舱、荧光显微镜和流式细胞术，能够通过βIII-微管蛋白免疫染色定性评估神经元结构完整性，并通过DHR荧光探针定量测量细胞内ROS水平。通过对硫莱菔子素、硫氧还蛋白和胸腺醌三种不同作用机制的抗氧化剂进行评估，该平台成功区分了它们在不同浓度和暴露时间下的保护效果谱：硫氧还蛋白在低浓度短时暴露下效果显著，硫莱菔子素在高浓度长时孵育下更优，而胸腺醌则在中等浓度达到最佳效果。这项工作确立了一种无需专用高氧设备即可在标准实验室实施的工作流程，为研究神经元氧化应激和筛选神经保护剂提供了一种通用方法。未来的研究将在此基础上评估更多抗氧化剂，并整合神经元功能活动的测量指标。
