基于药物骨架设计的可激活19F NMR探针用于评估髓过氧化物酶相关炎症

《Chemical Science》：Activatable 19F NMR probes from drug scaffolds for assessing myeloperoxidase-associated inflammationOpen Access

　　

髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）衍生的次氯酸（HClO）是脓毒症和神经炎症等炎症性疾病中的关键氧化剂。在复杂生物基质中选择性检测MPO衍生的HClO仍具有挑战性。19F NMR波谱具有零背景、环境敏感的化学位移以及易于定量等优势。本文报道了一系列基于药物衍生的硝酮类19F NMR探针（19FP-1至19FP-14），该类探针通过硝酮氧化对HClO产生特异性响应，并产生明显的19F化学位移变化。通过系统筛选，研究人员确定19FP-10为最优探针，其化学位移变化超过2 ppm，对其它活性氧物种具有高选择性，并对HClO呈现线性浓度依赖性响应。重要的是，19FP-10能够有效检测脓毒症模型小鼠血浆中的HClO，并在神经炎症模型中区分发炎脑组织与健康脑组织。此外，19FP-10可保护细胞免受氧化应激损伤，并表现出良好的体内生物安全性，彰显了其临床转化潜力。该研究成功建立了一类基于药物骨架的可激活19F NMR探针，兼具低毒性和高选择性，为评估MPO相关炎症提供了一种可临床转化的分子工具。

**研究背景与问题**

髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是一种主要在中性粒细胞、小胶质细胞和单核细胞中表达的关键酶，在宿主防御中发挥重要作用。然而，其过度或失调的活性与多种炎症性疾病密切相关。在过氧化氢（H₂O₂）和氯离子（Cl^?）存在下，MPO通过氯化循环主要产生次氯酸（HClO），并通过过氧化循环产生酪氨酰自由基。这些活性物种氧化宿主的DNA、RNA、蛋白质和脂质等生物分子，导致组织损伤及神经炎症、脓毒症等多种病理状况。神经炎症是阿尔茨海默病和多发性硬化的核心病理过程，涉及持续的小胶质细胞活化和外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润；脓毒症则是宿主对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。在这两种疾病中，MPO衍生的HClO均导致血管功能障碍并放大炎症级联反应。因此，能够选择性检测MPO衍生HClO的分子工具对这些MPO相关炎症疾病的早期诊断和治疗监测具有重要潜力。

尽管体内成像技术能提供实时动态信息，但设备成本高、操作复杂和定量困难限制了其在常规临床筛查中的应用。相比之下，利用血浆或组织液样本进行体外检测具有简单、低成本、易于标准化和适合大规模筛查等优势。在各种体外检测平台中，19F NMR因其独特的优势而突出：内源性氟背景的完全缺失确保了无干扰检测；19F化学位移对局部环境变化极为敏感；信号强度与浓度之间的线性关系使定量分析简便可靠。此外，在标准400 MHz NMR波谱仪上，仅0.03 ppm的化学位移差异通常就足以实现两个单峰19F信号的基线分离，即使在血浆或组织匀浆等复杂生物基质中也能可靠检测。尽管已有若干针对HClO的19F NMR探针被报道，但多数依赖强度型读数且局限于肝脏/肾脏模型，至今尚无直接检测MPO相关炎症的稳健19F NMR探针报道。

实际上，已发展了多种用于HClO传感的反应性官能团（如硫缩酮基团、芳香硫醚和C＝N键），但这些主要适用于荧光检测，将其扩展到19F NMR读数并非直接可行，且其安全性有待验证。近期研究表明，硝酮骨架可被HClO轻易氧化，为将HClO识别转化为可检测信号提供了直接的化学手段。除上述反应优势外，硝酮骨架还表现出低细胞毒性和良好的安全性。以α-苯基-N-叔丁基硝酮（PBN）为代表的硝酮类化合物在其有效浓度范围内表现出优异的生物相容性。此外，硝酮在神经退行性疾病模型中具有公认的神经保护活性，其临床转化潜力已由NXY-059（一种达到急性缺血性卒中III期临床试验的第二代硝酮衍生物）所证实。基于这些优势，研究人员旨在利用基于硝酮的HClO响应化学产生独特的19F NMR化学位移变化。

**研究内容与结论**

研究人员报道了一系列基于药物衍生的硝酮类19F NMR探针（19FP-X），用于特异性检测MPO衍生的HClO。通过系统筛选，确定了19FP-10为最优候选探针，兼具硝酮骨架的低细胞毒性和良好的安全性以及神经保护潜力。经HClO激活后，19FP-10显示出显著的化学位移变化（>2 ppm），并对其他活性氧物种具有良好选择性。该探针能够在复杂生物基质中准确定量HClO——在脓毒症模型的小鼠血浆中得到了验证，并能进一步区分神经炎症模型中的发炎脑组织与健康脑组织。总之，该工作建立了一类新的基于药物来源、低毒性、可激活的19F NMR探针，有望用于MPO相关炎症的特异性诊断，并为炎症性疾病筛查提供新方法。

**关键技术方法**

该研究采用了以下主要技术方法：（1）基于硝酮骨架的分子设计与筛选策略，通过在α-苯基-N-叔丁基硝酮核心的邻位或对位引入含氟报告基团（F或CF₃），并系统改变取代基电子效应和芳香核心，合成14种候选探针，通过19F NMR化学位移变化和反应效率进行筛选；（2）19F NMR检测体系，采用非去耦19F NMR进行定量以避免核Overhauser效应引起的信号变化，确定纵向弛豫时间（T₁）后设置合适的循环延迟确保完全弛豫；（3）动物模型构建，利用盲肠结扎穿刺（CLP）建立脓毒症小鼠模型（C57BL/6小鼠），通过右侧大脑半球单侧注射脂多糖（LPS）建立神经炎症模型；（4）生物安全性评估，包括MTT法检测HT22小鼠海马神经元细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡、DCFH-DA荧光染色检测活性氧水平以及尾静脉注射后主要器官的H&E染色组织学分析。

**研究结果**

*分子设计与筛选*：研究人员在PBN核心的邻位或对位引入含氟报告基团（F或CF₃）合成了19FP-1至19FP-4，进一步合成了含供电子（OCH₃）或吸电子（Cl）取代基的类似物（19FP-5至19FP-7），并用吡啶替代苯环以提高水溶性和19F化学位移敏感性（19FP-8至19FP-10）。大多数化合物经HClO氧化后化学位移差异超过2 ppm（19FP-3仅约0.2 ppm）。反应效率分析显示，19FP-1、19FP-3和19FP-4的反应效率低于10%，其余化合物的效率约为30%或更高，其中19FP-10效率最高（>50%）。对19FP-10的N-叔丁基部分进行结构修饰得到19FP-11至19FP-14，但这些类似物的反应效率均未超过19FP-10。综合结果表明，19FP-10兼具大化学位移变化（>2 ppm）和最高的反应效率（>50%），被确定为最优探针。

*反应性与选择性评估*：19FP-10仅对HClO产生显著19F NMR位移（从?62.2 ppm到?59.8 ppm），对其他活性氧物种及生物分子（GSH和FBS）的响应可忽略不计，并通过¹H/¹³C NMR和HRMS验证了氧化产物结构。19FP-10与MPO酶反应系统孵育后出现19F NMR响应，而MPO抑制剂4-ABAH共处理可抑制该响应，证实探针可检测MPO衍生的HClO。在0.4–2 mM HClO浓度范围内，传感产物峰（δ_19F = ?59.8 ppm）的相对强度逐渐增加，建立了线性定量关系（Y = 34.08X + 19.2，R² = 0.996）。在20%新鲜小鼠血浆中，0–1.2 mM范围内呈良好线性关系（Y = 52.93X + 19.2，R² = 0.987），检测限（LOD）为19.8 μM，定量限（LOQ）为65.3 μM。血浆加标回收率为97.6%–98.9%，相对标准偏差为4.1%–7.9%。19FP-10在不同pH条件和长期储存下均未降解，表现出优异的稳定性。

*脓毒症血浆诊断*：利用CLP方法建立脓毒症小鼠模型，通过H&E染色观察到肝和肾组织损伤，且IL-6和IL-1β水平显著升高，确认模型成功建立。将19FP-10（100 μM）与20%或40%脓毒症血浆孵育30分钟后，19F NMR谱中出现传感产物的特征峰（?59.8 ppm），而健康血浆组无此信号。响应效率随血浆比例从42.8%（20%脓毒症血浆）增加至68.2%（40%脓毒症血浆），表明产物峰强度与血浆比例呈正相关，反映了氧化应激的程度。

*炎症脑组织中HClO的检测*：通过向右侧大脑半球单侧注射LPS建立神经炎症小鼠模型。Western blotting和免疫染色显示，LPS注射后两个半球的MPO表达均显著升高，右侧（注射侧）高于左侧（未注射侧），证实成功诱导了局部神经炎症。将19FP-10（100 μM）与左右半球脑组织匀浆孵育后，LPS处理小鼠的两个半球均出现氧化产物的新峰，右侧强度高于左侧；WT小鼠组织中仅检测到可忽略的信号。定量分析显示，LPS注射小鼠右侧半球的响应效率（68.9%）显著高于左侧半球（46.8%），与炎症区域MPO表达升高和HClO产生增加一致。

*19FP-10的低细胞毒性*：在HT22小鼠海马神经元细胞中，19FP-10在20 μM浓度下未显著降低细胞活力。研究人员意外发现19FP-10可减轻氧化应激诱导的细胞损伤：5 mM谷氨酸或400 μM H₂O₂处理24小时使细胞活力降至对照的约50%，而19FP-10（1或10 μM）预处理剂量依赖性地恢复了细胞活力。19FP-10降低了H₂O₂诱导的细胞内活性氧积累，上调了Nrf2蛋白表达，表明激活了Nrf2介导的抗氧化通路。流式细胞术显示，19FP-10预处理将H₂O₂诱导的细胞总凋亡率从27.24%降至11.56%。此外，19FP-10有效逆转了H₂O₂刺激引起的IL-6和IL-1β分泌增加。体内安全性方面，尾静脉注射24小时后主要器官的H&E染色显示探针组与PBS组相当，未观察到器官损伤。

**讨论与结论**

该研究成功将硝酮骨架这一公认的神经保护药效团转化为一类可激活的19F NMR探针，用于检测MPO衍生的HClO。通过系统结构优化确定19FP-10为最优探针，具有高选择性、显著的化学位移响应和低细胞毒性。在脓毒症小鼠血浆中，该探针以血浆比例依赖性方式检测到升高的HClO水平；在LPS诱导的神经炎症模型中，探针以区域特异性分辨率清晰区分发炎与健康脑组织，且与MPO表达水平良好相关。19FP-10观察到的附加细胞保护效应凸显了硝酮核心保留的生物活性，提供了检测与保护的双重功能潜力。探针表现出良好的体内安全性，尾静脉注射未引起器官损伤。该探针平台建立了一种将MPO活性转化为独特19F NMR信号的化学策略，为未来通过19F MRI或¹⁸F PET进行炎症体内成像铺平了道路。