绵羊MSC源性神经元样细胞对痒病暴露的时间依赖性转录组响应

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Time-dependent transcriptomic response to scrapie exposure in ovine MSC-derived neuron-like cells

　　

朊病毒病（prion diseases）是致命的神经退行性疾病，其中对朊病毒暴露的早期分子反应仍未完全阐明，尤其是在天然易感宿主中。在本研究中，研究人员对暴露于经典痒病（classical scrapie）脑匀浆的绵羊间充质干细胞（ovine mesenchymal stem cell, oMSC）源性神经元样细胞进行了RNA测序（RNA-sequencing）分析，并将其转录组响应与暴露于正常脑匀浆的细胞进行比较。分别在接种后第2天（days post-inoculation, dpi）和第4天对细胞进行分析。差异表达分析在2 dpi鉴定出76个基因，在4 dpi鉴定出124个基因，两个时间点之间的重叠有限，表明对痒病暴露存在动态响应。在2 dpi，上调基因富集的生物学过程主要涉及信号传导和免疫相关的转录响应，而下调基因则富集于发育、形态发生和脂质相关过程。在4 dpi，转录谱以更广泛的基因抑制为主导，功能特异性降低。对八个选定基因进行的实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析在大多数情况下支持了RNA-seq检测到的变化方向。总体而言，这些结果表明，痒病暴露在绵羊oMSC源性神经元样细胞中引发了一种时间依赖性的转录响应，并为在天然易感物种中研究与朊病毒暴露相关的早期分子反应提供了一个探索性框架。

研究背景

朊病毒病（prion diseases），亦称传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies, TSEs），是一类致命的神经退行性疾病，影响人类和多种动物，包括人类的克雅氏病、绵羊和山羊的经典痒病（classical scrapie）、牛海绵状脑病以及鹿类的慢性消耗性疾病。这类疾病与错误折叠的朊蛋白（PrP^Sc）在中枢神经系统的积累以及进行性的突触功能障碍和神经元丢失密切相关。尽管已有大量研究，但朊病毒及其类似疾病的精确致病机制仍不完全清楚，目前也缺乏有效的治疗方法来阻止疾病进展。

当前朊病毒研究面临的一个主要挑战是，缺乏既能捕捉神经毒性反应，又能保持与天然易感宿主及田间毒株相关性的易于操作的体外系统。经典的永生化细胞系虽有助于研究朊病毒的复制和毒株特性，但它们通常无法提供关于神经退行性终点的充分信息，且可能需要朊病毒毒株的宿主适应。相反，原代神经元培养和器官型脑片培养能够再现朊病毒相关的神经病理学特征，包括神经元丢失和空泡化，但其应用受限于需要持续牺牲动物以及可扩展性差，特别是在天然易感的反刍动物物种中。从发病机制角度看，朊病毒相关的神经毒性至少可以部分地与大量的朊病毒增殖和蛋白酶抗性PrP^Sc的明显沉积分离开来，因为早期的突触功能障碍和细胞应激反应往往发生在明显的PrP^Sc沉积之前或与之同时发生。

鉴于朊病毒相关的神经毒性信号传导需要细胞朊蛋白（PrP^C）的存在，那些表达PrP^C但不支持持续性朊病毒复制的细胞系统仍然可用于研究朊病毒相关的细胞反应。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）代表了一种来自天然易感物种的实用细胞资源，它们可以从可获取的组织中分离，表达PrP^C，并且可以分化为神经元样细胞。此前的研究显示，来自痒病感染绵羊的绵羊MSCs（oMSCs）不表现出可检测的感染性，并且在标准生长条件下不会传播PrP^Sc，然而神经元样分化允许在接触痒病脑物质后短暂维持PrP^Sc水平。这些观察结果支持将分化的oMSC源性神经元样细胞用作一个平台，来研究天然易感宿主背景下与朊病毒相关神经毒性刺激有关的宿主和谱系依赖性分子反应。

因此，本研究旨在通过对暴露于经典痒病脑匀浆和正常脑匀浆对照的绵羊oMSC源性神经元样细胞进行RNA-seq转录组分析，以表征在天然易感宿主背景下对朊病毒相关刺激的细胞反应。

研究设计与结论

研究人员从一只携带ARQ/ARQ基因型的雌性Rasa Aragonesa绵羊的骨髓中分离出MSCs，经扩增后进行神经源性分化，并在分化高峰时将其分别暴露于痒病脑匀浆（DN_SCR）和正常脑匀浆（DN_NBH），同时设置仅含培养基的对照组（DN_MO）。在接种后第2天（2 dpi）和第4天（4 dpi）收集细胞，提取RNA并进行RNA-seq分析，随后通过RT-qPCR验证部分差异表达基因（DEGs）。研究得出结论：痒病暴露在绵羊oMSC源性神经元样细胞中引发了一种时间依赖性的转录响应，早期以信号传导和免疫相关通路的激活以及发育和代谢程序的抑制为特征，后期则以更广泛的基因下调和功能特异性降低为主导。该研究为在天然易感物种中研究与朊病毒暴露相关的早期分子反应提供了探索性框架。

关键技术方法

1. 1.
   细胞模型构建：从一只携带ARQ/ARQ基因型的雌性Rasa Aragonesa绵羊的骨髓中分离MSCs，并使用HyClone AdvanceSTEM? Neural Differentiation Kit诱导其向神经元样细胞分化。
2. 2.
   转录组测序与分析：对暴露于痒病脑匀浆（DN_SCR）和正常脑匀浆（DN_NBH）的细胞在2 dpi和4 dpi进行RNA-seq，使用DESeq2 R包进行差异表达基因（DEGs）鉴定，并通过ShinyGO进行GO和KEGG富集分析。
3. 3.
   实验验证：采用RT-qPCR技术，对2 dpi时筛选出的八个DEGs进行表达趋势验证，并以RefFinder工具评估的稳定内参基因进行标准化。

研究结果

3.1 RNA-seq数据质量：所有样本的测序数据质量高，平均92%的读段比对到绵羊参考基因组，大部分读段比对到外显子区域，组内样本间相关性高。

3.2 全局转录组分离：主成分分析（PCA）显示，两个实验时间点（2 dpi和4 dpi）之间存在明显的聚类分离。在2 dpi，DN_SCR与DN_NBH样本沿主成分呈部分分离；而在4 dpi，这种分离减弱，两组样本聚类更为接近。

3.3 痒病与对照接种培养物的差异基因表达：在2 dpi，共鉴定出76个DEGs，其中45个上调，31个下调。在4 dpi，鉴定出124个DEGs，但响应强烈偏向于下调，仅有14个上调基因和110个下调基因。两个时间点之间的DEGs重叠非常有限，只有7个共同的下调基因，表明转录响应是动态变化的。

3.4 T1（2 dpi）DEGs的功能富集分析：上调基因显著富集于免疫系统激活和细胞信号传导相关的生物学过程，如白细胞活化和分化、免疫系统发育等。下调基因则主要富集于发育和形态发生过程，如感觉系统发育、上皮细胞增殖，以及脂质、固醇和胆固醇生物合成相关的代谢通路。

3.5 T2（4 dpi）DEGs的功能富集分析：与T1相比，T2的转录响应更为有限且特异性较低。下调基因富集于更宽泛的生物学过程，如解剖结构发育、信号传导调控和细胞对化学刺激的响应。上调基因未检测到稳健的富集类别。

3.6 RNA-seq结果的RT-qPCR验证：对选自T1的八个基因进行RT-qPCR验证，结果显示，其中七个基因的表达变化方向与RNA-seq一致，六个基因（UEVLD, ZFP36L2, NUFIP2, CPEB2, AK4, CYP1B1）达到名义上的统计显著性，支持了RNA-seq结果的可靠性。

讨论与结论

讨论部分指出，在2 dpi观察到的早期转录响应，特别是免疫信号、白细胞活化等相关通路的富集，与先前报道的早期朊病毒相关免疫反应一致，反映了保守的免疫调节和应激响应途径。同时，下调基因涉及的发育、形态发生及脂质代谢过程，暗示了痒病暴露扰乱了细胞的结构维持和分化状态。在4 dpi，转录谱以广泛的基因抑制和低功能特异性为特征，表明这是一个不同于早期的、可能由细胞应激或毒性参与的阶段。研究还强调了该模型的价值，即可以在表达PrP^C且能短暂维持PrP^Sc的神经元样分化细胞中，研究非复制条件下的早期分子事件，并与未分化MSCs的结果形成对比，揭示了细胞背景对转录响应的影响。

研究结论总结如下：分化的绵羊oMSC源性神经元样细胞在暴露于痒病后，表现出一种时间依赖性的转录响应，其特征为早期信号传导和免疫相关通路的改变，同时伴随着发育和代谢程序的抑制，随后进入一个以广泛基因下调和功能特异性降低为主的后期阶段。在该实验系统的局限性范围内，这些发现为与痒病暴露相关的分子反应提供了探索性的转录组学描述，并强调了细胞背景在塑造对朊病毒相关刺激的转录响应中的重要性。未来需要使用更多生物学供体和接种物的研究来确定这些变化的可重复性和代表性。