《Veterinary Immunology and Immunopathology》：γδ T cell knockout chickens as a model to investigate the T cell response against Infectious Bursal Disease infection
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传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种禽双RNA病毒（Avibirnavirus），通过免疫抑制、继发感染和死亡率增加给全球养鸡业造成经济损失。经口摄入后，IBDV传播至包括法氏囊（BF）在内的淋巴组织，法氏囊是鸡的主要淋巴器官。IBDV破坏法氏囊B淋巴细胞这一
传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种禽双RNA病毒（Avibirnavirus），通过免疫抑制、继发感染和死亡率增加给全球养鸡业造成经济损失。经口摄入后，IBDV传播至包括法氏囊（BF）在内的淋巴组织，法氏囊是鸡的主要淋巴器官。IBDV破坏法氏囊B淋巴细胞这一主要靶细胞，进而导致体液免疫和细胞介导免疫的抑制。IBDV在法氏囊中的复制与CD3+ T细胞从接种后第1天（dpi）开始的增加相关，这种增加可能持续至至少7 dpi。研究区分了IBDV感染急性期法氏囊中CD4+和CD8+ T细胞的增加。法氏囊内CD4+和CD8+ T细胞的数量可能因鸡的基因型、IBDV感染时的日龄和病毒株而异。此外，有研究提示调节性T细胞（Tregs）在IBDV感染后浸润法氏囊。基于化学或手术T细胞受损鸡的实验研究，研究人员推测T细胞可能在IBDV感染早期控制病毒复制，但也可能延迟法氏囊恢复。T细胞可通过其αβ或γδ T细胞受体（TCR）进行区分。6月龄鸡中高达66%的循环CD3+细胞为γδ T淋巴细胞。因此，鸡与猪和牛一样，被归类为所谓的γδ T细胞高表达物种。γδ T细胞在鸡病毒感染中的作用尚未完全阐明。研究人员描述了其细胞毒活性，并提示它们在固有免疫和适应性免疫应答中发挥作用。在体外使用抗原致敏的鸡脾细胞进行的抗原诱导抑制试验中，研究人员认识到γδ T细胞的免疫抑制活性。通常在法氏囊中γδ T淋巴细胞较为罕见。IBDV感染后，在胸腺、脾脏和法氏囊中观察到γδ T淋巴细胞的短暂增加。在本研究中，研究人员旨在了解T细胞（特别是γδ T淋巴细胞）在IBDV发病机制中的作用。研究人员使用了TCR Cγ?/?鸡模型，由于TCR γ链恒定区的敲除，γδ T淋巴细胞缺失。与野生型（WT）鸡相比，TCR Cγ?/?（KO）鸡在脾脏中表现出增加的Vβ1? αβ T细胞数量，以及在脾脏、胸腺和盲肠中不同CD8? T细胞亚群数量的增加，这取决于鸡的日龄，可能补偿了γδ T淋巴细胞的缺失。研究人员的目标是比较WT和KO鸡法氏囊中IBDV复制和病毒清除，以及法氏囊病变发展和恢复。使用免疫组织化学，研究人员研究了γδ T和αβ T细胞以及不同T细胞亚型（如辅助性T细胞和细胞毒性T细胞）对法氏囊的浸润。为了进一步表征T细胞亚群（包括Tregs、1型辅助性T细胞（Th1）和细胞毒活性），研究人员采用逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测选定细胞因子和Tregs标志物叉头框蛋白3（FoxP3）的mRNA表达模式。干扰素-γ（IFN-γ）被用作Th1细胞活性的标志物，而颗粒酶A（GZMA）作为细胞毒性T细胞活性的指标。该研究为法氏囊中传染性法氏囊病发病机制中T细胞亚群的动态变化提供了见解。
γδ T细胞敲除鸡模型揭示IBDV感染中T细胞应答的动态机制：一项基于TCR Cγ?/?鸡模型的系统研究
一、研究背景与问题提出
传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV）是一种禽双RNA病毒（Avibirnavirus），通过免疫抑制、继发感染和死亡率增加给全球养鸡业造成重大经济损失。IBDV经口摄入后传播至法氏囊（bursa of Fabricius, BF）——鸡的主要淋巴器官，并以法氏囊B淋巴细胞为主要靶细胞，破坏B细胞导致体液免疫和细胞介导免疫的抑制。IBDV在法氏囊中的复制伴随CD3? T细胞从接种后第1天（days post-inoculation, dpi）开始的增加，且CD4?和CD8? T细胞在急性期均出现浸润增加，其数量受鸡基因型、感染日龄和病毒株影响。既往研究提示T细胞可能在IBDV感染早期控制病毒复制，但也可能延迟法氏囊恢复，但T细胞亚群（特别是γδ T细胞）在IBDV发病机制中的具体作用尚不明确。
鸡是γδ T细胞高表达物种，6月龄鸡循环CD3?细胞中高达66%为γδ T淋巴细胞，但γδ T细胞在鸡病毒感染中的功能尚未完全阐明。既往研究提示γδ T细胞具有细胞毒活性和免疫抑制活性，且在IBDV感染后在胸腺、脾脏和法氏囊中短暂增加。然而，γδ T细胞在IBDV发病机制中的确切作用缺乏直接的功能验证。为此，研究人员利用TCR Cγ?/?（KO）鸡模型——通过敲除TCR γ链恒定区使γδ T淋巴细胞缺失——系统比较了KO鸡与野生型（WT）鸡在IBDV感染后法氏囊中的病毒复制、病毒清除、病变发展及恢复过程，并深入分析T细胞亚群浸润和功能分子的动态变化，以期阐明γδ T细胞在IBDV发病机制中的作用。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员开展了3次独立实验（E1-E3），将14日龄雏鸡随机分为IBDV接种WT（IWT）、病毒-free对照WT（CWT）、IBDV接种KO（IKO）和病毒-free对照KO（CKO）四组，于3周龄经口接种商业化IBDV中等加强疫苗株（Nobilis? Gumboro 228E），并在3、7、21和28 dpi进行剖检采样。主要技术方法包括：免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测法氏囊中IBDV抗原及免疫细胞群（TCR2? αβ T细胞、TCR1? γδ T细胞、CD4?辅助性T细胞、CD8β?细胞毒性T细胞、KUL01?巨噬细胞样细胞）；逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测IFN-γ、颗粒酶A（GZMA）和叉头框蛋白3（FoxP3）的mRNA表达；ELISA检测抗IBDV抗体；组织学评估B细胞耗竭滤泡百分比；主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）整合免疫组化和RT-qPCR数据以分析T细胞亚群分布模式。实验鸡来源于德国慕尼黑工业大学动物研究中心提供的TCR Cγ?/? × TCR Cγ?/?鸡系种蛋，在汉诺威兽医学院禽病诊所隔离设施中饲养。
三、研究结果
3.1 临床体征、大体病变和IBDV血清转化
所有组均未观察到临床体征或死亡。IBDV接种组在3和7 dpi出现法氏囊水肿和脾脏增生，21 dpi出现法氏囊萎缩，病变程度在组间相当。血清转化始于7 dpi，28 dpi时KO鸡S/P比值中位数（3.1）高于WT鸡（2.16），但差异未达显著水平。
3.2 法氏囊内IBDV抗原检测、病变发展和恢复
3 dpi时，IBDV接种鸡的数据点聚为两簇：一簇为低IBDV抗原载量和低B细胞耗竭滤泡，另一簇中KO鸡比WT鸡具有更高的IBDV抗原阳性和B细胞耗竭滤泡。7 dpi时，所有WT鸡和五分之四的KO鸡显示100%滤泡B细胞耗竭。21 dpi时，两组IBDV抗原阳性滤泡数量相当，但9/11的KO鸡B细胞耗竭滤泡低于90%，而WT鸡仅5/11低于90%。28 dpi时差异更为显著：3/4的KO鸡和仅1/4的WT鸡B细胞耗竭滤泡低于60%；病毒载量方面，3/4的KO鸡和1/4的WT鸡IBDV抗原阳性滤泡低于30%。结果表明KO鸡表现出更快的病毒清除和法氏囊恢复。
3.3 法氏囊内T细胞群研究
病毒-free状态下，3周龄时KO鸡的CD4?和CD8?阳性滤泡数显著高于WT鸡，TCR2?滤泡呈类似趋势。IBDV接种后，3 dpi时KO鸡的TCR2?、CD4?和CD8β?阳性滤泡数均显著高于WT鸡；7 dpi时KO鸡CD4?滤泡显著减少；21和28 dpi时两组TCR2?和CD8β?细胞数相当，但21 dpi时KO鸡CD4?和CD8β?细胞呈下降趋势。
3.4 IFN-γ、FoxP3和GZMA mRNA表达
病毒-free状态下WT和KO鸡的IFN-γ、FoxP3和GZMA mRNA表达相当。IBDV接种后，除3 dpi时WT鸡FoxP3外，各指标均显著高于同基因型病毒-free鸡。FoxP3 mRNA在3和6周龄时KO与WT接种鸡间存在差异表达，6周龄时达显著水平；IFN-γ和GZMA mRNA在两组间各时间点均相当。
3.5 T细胞亚群模式的主成分分析
PCA显示，3 dpi时IKO鸡在Treg和Th1谱系中较IWT鸡更远离病毒-free组，提示KO鸡早期具有更高的Tregs和Th1细胞浸润；21 dpi时IKO鸡向病毒-free组靠拢，而IWT鸡仍分离，提示KO鸡T细胞应答更早消退。细胞毒性谱系中，3 dpi时更多IKO鸡在PRIN1上远离病毒-free组且PRIN2上呈现独特聚类，受TCR1影响显著；21 dpi时IKO鸡向病毒-free组靠拢。各变量在21 dpi时TCR2、CD8β、TCR1和GZMA间相关系数均大于0.7。
3.6 法氏囊内巨噬细胞检测
病毒-free组间KUL01?细胞数在各时间点相当。IBDV接种导致KUL01?细胞增加，3 dpi时IWT组和7 dpi时IWT和IKO组均显著增加；慢性期各组间相当。
四、讨论与结论
研究结果表明，γδ T细胞敲除导致病毒-free KO鸡法氏囊中Vβ1? αβ T细胞、CD4?和CD8β?细胞数量增加，提示αβ T细胞对γδ T细胞缺失的功能性补偿。IBDV接种后，KO鸡在3 dpi时具有更高的法氏囊内CD4?辅助性T细胞和CD8β?细胞毒性细胞浸润，伴随更快的病毒清除和法氏囊恢复；21 dpi时KO鸡T辅助细胞和细胞毒性细胞数量低于WT鸡，而此时WT鸡中这些细胞可能参与了延长的法氏囊破坏。PCA分析进一步支持KO鸡早期更强的Tregs和Th1应答及细胞毒性αβ T细胞浸润，且这些应答在慢性期更快消退。研究提示αβ T辅助细胞对IBDV控制具有重要作用，γδ T细胞的缺失可能被αβ T细胞过度补偿，从而加速法氏囊恢复。研究人员推测γδ T细胞可能具有调节功能，其缺失改变了T细胞亚群的动态平衡，但尚不能排除自然杀伤（NK）细胞在IBDV控制中的潜在代偿作用。巨噬细胞在两组中均参与早期IBDV控制，但未因γδ T细胞缺失而改变。研究也存在局限性，包括亲代鸡群差异导致的实验间变异、部分离群鸡可能具有延迟的T细胞浸润或替代性免疫应答通路。综上所述，γδ T淋巴细胞的缺失与法氏囊内CD4?和CD8β? αβ T细胞数量增加相关，功能性αβ T细胞的增加使KO鸡能够更快、更有效地控制早期IBDV复制；21 dpi时KO鸡更快的病毒清除和滤泡恢复与较低的法氏囊内细胞毒性和辅助性T细胞数量一致，而在WT鸡中这些细胞可能导致了延长的法氏囊破坏。进一步针对特定T细胞亚群的功能研究将有助于深入理解T细胞在IBDV发病机制中的作用，并为改进干预策略提供基础。
