基于氢键辅助基团的苯硼酸荧光分子报告器用于哺乳动物糖类检测

《Chemical Science》：Molecular reporters for mammalian sugars via hydrogen bonding auxiliariesOpen Access

　　

： 糖类（Glycans）是传递生物信息的关键分子。然而，其复杂且动态的结构难以表征，这成为全面理解其生物学功能的重大障碍。本研究表明，在荧光开启型（turn-on）苯硼酸（phenylboronic acid, PBA）报告器的硼位点邻近处引入氢键辅助基团，可作为调节其对哺乳动物糖类灵敏度的关键因素，提供了一种类似于凝集素（lectin）结合口袋中氢键网络的新设计原理。研究人员证明，这些辅助基团既能整体调节灵敏度，也能针对单个哺乳动物糖类进行调节，并揭示了单糖异头形式（anomeric forms）之间显著差异性的开启响应。通过凝胶内糖蛋白成像（in-gel glycoprotein imaging）、流式细胞术（flow cytometry）和细胞表面可视化实验，展示了这些选择性和可逆分子报告器的多功能性，确立了其作为研究哺乳动物糖类的通用化学平台的地位。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

糖类（Glycans）是细胞信号传导和通讯的重要信息传递分子，广泛存在于所有生命域中。它们通常以共价方式连接于蛋白质和脂质等结构生物大分子上。与基因组直接模板化编码的蛋白质不同，糖类结构的合成与修饰由一系列高度调控的酶催化完成，这些酶执行非化学计量反应，导致不同底物上产生可变的修饰。因此，细胞的糖表型（glycophenotype）高度依赖于环境背景，并随细胞状态和微环境变化而改变。例如，癌细胞常表现出糖基化模式的改变，如唾液酸化水平升高和高度分支的N-连接糖链增加。然而，由于糖类结构和动态变化表征困难，其传递生物信息的分子密码仍未得到充分理解。

对糖类结构进行成像分析，对于细胞过程和疾病的机制研究至关重要。自然界利用多种糖类结合蛋白（包括凝集素，lectins）来解码糖类的分子信息，但这些蛋白存在交叉反应、商业化种类有限以及批次间差异等问题。因此，开发补充性的糖类报告工具对于推动糖生物学新发现具有重要意义。

苯硼酸（phenylboronic acid, PBA）能够与碳水化合物上的顺式二醇（cis-diols）形成可逆的动态共价键，是一种有前景的糖类选择性标记策略。低pK_a的PBA（如Wulff型邻氨基甲基PBA）在中性pH下可结合多种二醇底物，已被探索用于葡萄糖及其他生物糖类的检测。荧光开启型（turn-on）PBA报告器在结合底物后发射增强，特别适合高对比度成像。然而，报告器分子结构与其对特定碳水化合物灵敏度之间的关系仍不完全清楚。

二、研究内容与核心发现

本研究报道了荧光开启型PBA报告器中，硼位点邻近的氢键辅助基团可控制对中性哺乳动物糖类的检测灵敏度。研究人员受凝集素-碳水化合物结合口袋中氢键网络控制选择性的启发，假设在PBA硼位点邻近调控化学环境可通过氢键作用提供对特定糖类的可调灵敏度。在确定合适的基底支架后，研究人员证明硼位点邻近的辅助基团能够全局性和针对性地控制对单个哺乳动物糖类的灵敏度，并观察到单糖不同异头形式之间显著的开启响应差异。这些选择性且可逆的分子报告器在凝胶内糖蛋白成像、流式细胞术和细胞表面可视化中的成功应用，展示了其作为研究哺乳动物糖类的通用化学工具的潜力。

三、主要关键技术方法

研究人员设计并合成了一系列基于硼二吡咯亚甲基（BODIPY）荧光团的邻氨基甲基PBA基底支架（A–C），通过光物理性质筛选和合成产率比较，选定化合物C作为进一步衍生化的基底。随后通过辅助基团修饰合成了衍生物C1–C9。研究采用等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry, ITC）验证PBA-二醇结合与荧光增强的相关性，并合成不含PBA的对照染料C*进行验证。利用荧光酶标仪系统评估了各探针对七种中性哺乳动物单糖（葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖、木糖）以及甲基化吡喃糖苷衍生物的开启响应。在应用层面，采用SDS-PAGE凝胶电泳结合荧光染色进行糖蛋白检测，并使用PNGase F酶处理验证糖链特异性，同时通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估了探针在活细胞和固定细胞上的标记性能。

四、研究结果

基底支架及其固有性质

研究人员合成了三种基于BODIPY的邻氨基甲基PBA基底支架A–C。光物理表征显示，化合物A未表现出荧光开启响应且量子产率低，而B和C在加入山梨醇后表现出显著的荧光开启响应和较高的量子产率。ITC实验测得B与山梨醇、果糖和葡萄糖的结合常数分别为239.8 M^?1、172.1 M^?1和51.5 M^?1，与荧光增强趋势一致。对照染料C*（不含PBA）未显示荧光变化，证实荧光增强来源于PBA-二醇复合物的形成。对七种哺乳动物单糖的筛选显示，B和C均表现出稳健的开启响应，而A无显著响应。鉴于C的合成产率（13.9%）明显高于B（3.1%），研究人员选择C作为进一步衍生化的基底。

氢键辅助基团全局性和针对性地控制检测灵敏度

研究人员在基底C上引入九种不同的辅助基团，合成了衍生物C1–C9。单糖筛选结果显示，C1–C7对所有底物均表现出弱或接近基线的荧光响应，而带有酰胺取代基的C8和带有羟基取代基的C9对大多数单糖底物表现出全局性增强的灵敏度。值得注意的是，C9对D-半乳糖的开启响应（ΔF/F₀ = 1.47）相比基底C（ΔF/F₀ = 0.16）提高了约9倍。C1和C9仅相差一个甲基，却导致荧光开启性能的显著差异。此外，C8和C9对单个单糖表现出明显不同的响应模式：C9对半乳糖和N-乙酰半乳糖胺响应强但对木糖响应弱，而C8对包括甘露糖和木糖在内的多种糖类均表现出中等强度的响应。利用甲基化吡喃糖苷衍生物固定异头构型的研究揭示，C8和C9均偏好α-葡萄糖异头体而非β-异头体，C8对半乳糖也表现出α-异头偏好。

复杂多糖的识别

C9对葡聚糖（Dextran，10 kDa和40 kDa）表现出稳健的荧光开启响应，且相同浓度下较大分子量的葡聚糖产生更高的信号增强，提示可能存在多价效应。C9在甘露聚糖溶液中表现出开启响应，但对硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素无显著荧光增强。在含5%或10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM培养基中，C9对其中糖蛋白混合物表现出随时间增强的荧光信号（ΔF/F₀最高达22），约6小时达到平台期。

选择性可逆的凝胶内糖蛋白检测

以胎牛血清蛋白（fetuin）为模型糖蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）为阴性对照进行SDS-PAGE凝胶电泳和C9荧光染色，结果显示fetuin被清晰标记而BSA无荧光信号，与商业化Pro-Q Emerald 300染色试剂盒结果一致。PNGase F处理去除N-连接糖链后，核糖核酸酶B（RNase B）的荧光信号消失且蛋白条带迁移位置改变，证实C9特异性结合糖链结构。用1 M山梨醇处理C9标记的凝胶5小时后，荧光信号显著降低，而PBS处理的对照组无明显变化，证实了标记的可逆性。在三种结直肠癌细胞系（HT29、HCT116和SW480）裂解物的凝胶染色中，C9相比C1产生更强的荧光信号和更高的信噪比，染色模式与Pro-Q Emerald 300试剂盒相当。

C9在流式细胞术和细胞成像中的应用

流式细胞术分析显示，C9标记的活THP-1细胞在所有测试浓度下均表现出最高的荧光强度，且洗脱实验中信号稳定。固定HT29细胞的共聚焦显微镜成像中，C9产生最强烈和清晰的荧光信号，而用200 mM山梨醇洗涤后荧光显著降低，进一步验证了标记的可逆性。

五、结论与展望

本研究证明，荧光开启型PBA报告器中的氢键辅助基团是调节中性哺乳动物糖类检测灵敏度的有效策略。受凝集素-碳水化合物天然相互作用中氢键网络控制亲和力和选择性的启发，研究人员建立了硼位点邻近辅助基团可显著改变对单个哺乳动物糖类开启响应的原理。单糖异头形式之间开启响应的显著差异，凸显了这些探针区分糖类非对映异构体和潜在连接方式的独特能力。这些报告器在凝胶内糖蛋白成像、流式细胞术和细胞显微成像等多个生物学分析平台上的成功应用，确立了其作为研究哺乳动物糖类化学工具的广泛实用性。

虽然当前平台尚不能实现对单一糖类或特定异头形式的绝对选择性，但这一局限并不削弱其在糖生物学中的广泛用途。PBA-二醇结合的可逆性为糖类微阵列应用提供了独特优势，允许单个微阵列与多种结构不同的PBA探针重复使用，从而从单一微阵列生成大规模数据集，这对机器学习算法的训练尤为有价值。该工作为下一代糖类分析建立了新的分子平台。