约束扩散使能的高表达稳健肽天冬酰胺连接酶FortiPAL-1的构建

《Chemical Science》：Constrained diffusion-enabled construction of a highly expressed and robust peptide asparaginyl ligaseOpen Access

　　

肽天冬酰胺连接酶（peptide asparaginyl ligases, PALs）在肽大环化（peptide macrocyclization）和蛋白质生物偶联（protein bioconjugation）方面具有广阔前景，但其广泛应用受到热稳定性不足和重组表达水平低的限制。研究人员通过整合计算与实验策略，结合从头序列生成（de novo sequence generation）、多模型引导突变（multi-model-guided mutagenesis）和PAL特异性功能优化，报道了一种扩散使能（diffusion-enabled）的PAL——FortiPAL-1。与天然PAL相比，FortiPAL-1表现出显著增强的热稳定性（熔解温度T_m = 69 °C，而典型PAL约为50 °C），并在大肠杆菌（E. coli）中实现了64 mg L^?1的可溶性酶原表达水平，大幅超过已报道的天然PAL表达水平，同时其催化效率与已知最快的天然PAL——butelase-1相当（k_cat/K_m = 1.3 × 10⁶ M^?1 s^?1）。值得注意的是，增强的结构稳定性并未转化为最适反应温度的相应迁移，凸显了整体折叠稳定性与催化性能之间的解耦。总之，这些结果表明，一种受约束的、扩散使能的工程工作流程可以将脆弱的酶支架转化为稳健的、可实际应用的生物催化剂，并强调了将生成式蛋白质设计与实验优化相结合，以将计算设计转化为高性能动态酶的重要性。

论文解读

肽天冬酰胺连接酶（PALs）是植物legumain酶家族中一类独特的C13半胱氨酸蛋白酶亚家族，能够高效催化肽键连接而非水解，在肽大环化、蛋白质特定位点修饰和细胞表面工程等领域具有重要应用前景。然而，天然PALs如butelase-1、OaAEP1b和VyPAL2存在多重固有缺陷：原核酶原表达水平普遍低于2 mg L^?1，熔解温度常在50 °C左右，且对pH变化敏感。这些因素严重限制了PALs在制备级或工业生物催化中的操作窗口。以往工程策略如密码子优化、末端截短、融合标签、表达系统更换和cap域稳定化虽在一定程度上改善了重组表达，但可溶性产量仍多低于20 mg L^?1；共有序列设计可提高表达却未改善热稳定性；连接酶活性决定区（LAD）突变可调节连接酶-蛋白酶平衡，但未解决内在折叠或稳定性问题。PALs的双域结构、酸依赖性激活和结构脆弱性使得单一目标的优化往往导致表达、稳定性和催化活性之间的权衡，亟需一种能同时优化多性能的整合策略。

研究人员采用扩散使能的多层级工程流程，系统解决PALs的耦合限制。首先，利用基于连续去噪扩散概率模型（DDPM）的SeqGenerator，在包含1500条植物legumain序列（其中18条为实验验证的PALs）的 curated 数据集上训练模型，生成序列多样化的legumain变体。这些生成序列在扩大序列空间的同时保留了催化残基（N59、H165、C207）和S1口袋形成残基等关键功能特征，经ProteinMPNN评分选出15个候选NeoLEG1-15。随后通过split-PAL表达策略在SHuffle T7 E. coli中进行小规模表达和活性筛选，鉴定出NeoLEG2和NeoLEG4具有高环化活性，其中NeoLEG2的环化/水解（C/H）比达9.83，且在35–60 °C温度范围内保持更稳健的连接偏向，被选为后续工程改造的母体。

为系统鉴定稳定性增强突变，研究人员综合使用FoldX、Rosetta_ddg和Pythia三种工具进行ΔΔG预测，排除催化三联体5 ?范围内的残基后，在核心域和cap域分别构建突变文库。通过基于FRET的初筛和更严格的热挑战复筛，从核心域单突变中鉴定出四个有益突变N138D、S267C、S272L和Q312E，其组合获得的四重突变体4M（N138D/S267C/S272L/Q312E）在pH 5.0下熔解温度达68.58 °C，较NeoLEG2（60.86 °C）显著提升，且热挑战后残余活性约为NeoLEG2的三倍。分子动力学（MD）模拟显示，4M突变体整体构象更紧凑，半径回旋（Rg）减小，两个热敏感loop区（残基165–169和232–236）的RMSF振幅显著降低，而催化三联体本身的柔性未受刚性化影响；N138D引入的额外氢键是唯一显著的局部相互作用变化，提示稳定性增强主要来自整体紧凑化和柔性区域再分布，而非广泛的新生氢键网络或疏水堆积重构。

在核心域稳定性提升的基础上，研究人员考察了cap域突变的表达增强效应。多数cap域单突变显示荧光信号升高主要源于蛋白表达增加而非热稳定性改善。将六个最有利的cap域突变S319P/S388E/S389E/R425P/S427G/S454C组合后，表达水平较NeoLEG2提高约40倍。随后将六个cap域表达增强突变与四个核心域稳定性突变组合，构建十重突变体10M，其表达水平约为NeoLEG2的40倍，同时保留了核心域突变赋予的高热稳定性。为进一步抑制水解副反应，研究人员在10M基础上进行LAD引导突变，将LAD1的闸门残基Gly237突变为Ala，并将LAD2的Thr167-Thr168二肽替换为Gly-Ala，获得最终优化变体FortiPAL-1。该变体在保持高表达和高稳定性的同时，进一步降低了水解副产物比例。

对FortiPAL-1的系统酶学表征显示，其在大肠杆菌中可溶性酶原表达量约为64 mg L^?1，较NeoLEG2提高40倍以上；活化后经SEC纯化，核心域回收率估计约为40 mg L^?1（以酶原表达量计）。pH活性谱表明其在pH 4.5–7.5范围内均有活性，最适pH为6.0；差示扫描荧光法（DSF）测得pH 5.0下T_m为68.46 ± 0.13 °C，显著高于butelase-1（pH 6.0下约52 °C）和OaAEP1b-C247A（pH 5.0下约51.95 °C）。温度活性谱显示最适反应温度为55 °C，高于天然PALs的典型最适温度；60 °C热处理10 min后快速冷却，可恢复接近未处理对照的活性，表明其具有良好的热恢复能力。以环化底物GIARGDYASNAL在pH 6.0、55 °C下测定动力学参数，k_cat/K_m为1.34 × 10⁶ M^?1 s^?1，与已知最高效天然连接酶butelase-1相当。底物特异性分析表明，P2′位置具有严格选择性，偏好Leu/Val/Cys/Met/Ile/Phe；P1″位置则耐受除Pro外的大部分氨基酸，但Pro会导致水解副产物增加至约65%；当P1″为Gly时，P2″位置偏好大体积疏水侧链（Trp、Leu、Phe、Ile），其中Trp给出最高连接/水解（L/H）比12.64。这些位置偏好与天然PALs的关键偏好一致，且不利的P2″残基倾向于促进水解而非保持无反应。此外，研究人员还通过EDC/NHS介导的表面电荷修饰策略，将乙醇胺偶联至侧链羧酸以中和负电荷，提高了酶在pH 6.5–7.5下的催化活性和T_m值，拓宽了FortiPAL-1在中性条件下的操作窗口。

讨论部分指出，FortiPAL-1的高T_m（约70 °C）与较低的最适催化温度（55 °C，pH 6.0）之间的解耦表明，高温下活性丧失并非由整体去折叠引起，而可能源于对催化相关loop动力学的局部扰动，妨碍了酶-底物复合物的有效形成。MD分析支持这一解释：稳定性突变主要通过再分配局部柔性、刚性化热敏感远端loop发挥作用，而非改变整体氢键或疏水堆积，提示一种长程熵稳定机制。此外，cap域突变对表达的增强并非来自内在催化稳定性变化，而可能反映折叠效率提高，说明在动态酶中重组表达可作为一个部分正交的优化维度。NeoLEG2虽不符合天然PALs的典型LAD基序，但仍偏向连接反应，提示LAD效应具有序列依赖性；FortiPAL-1中的LAD引导调整是在保持表达和稳定性前提下的折中优化。表面电荷修饰则借鉴了人legumain的类似策略，证明PAL特异性优化手段可有效应用于人工设计的酶支架。

结论：本研究通过约束引导的多层级工程策略，成功解决了动态酶支架中稳定性、表达和催化性能的耦合挑战。以PAL为模型，研究人员依次进行支架稳定化、表达增强和定向功能精细化，最终获得热稳定性显著提高、在大肠杆菌中高可溶性酶原表达且pH耐受范围扩大的稳健连接酶FortiPAL-1。该酶为肽连接、大环化和生物偶联提供了更具工业应用潜力的平台。更广泛地，本研究展示了将生成式蛋白质设计与约束感知的实验优化相结合，可将脆弱的天然或从头设计蛋白支架转化为可满足化学苛刻应用的实际生物催化剂。