《Frontiers in Ophthalmology》：Screening of natural compounds library for protection against endoplasmic reticulum stress in corneal endothelial cells
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目的：内质网（ER）应激介导的细胞死亡与多种眼部疾病有关，包括Fuchs角膜内皮营养不良（FECD）。天然化合物具有重要的药理活性，对关键的细胞信号通路必不可少，并在许多眼部疾病如糖尿病、视网膜病变和青光眼中被认为具有保护作用。然而，关于天然化合物在减轻持续性
目的：内质网（ER）应激介导的细胞死亡与多种眼部疾病有关，包括Fuchs角膜内皮营养不良（FECD）。天然化合物具有重要的药理活性，对关键的细胞信号通路必不可少，并在许多眼部疾病如糖尿病、视网膜病变和青光眼中被认为具有保护作用。然而，关于天然化合物在减轻持续性ER应激以提高角膜内皮细胞（CEnCs）存活率方面的研究有限。本研究的目的是鉴定易于获得的天然化合物，以改善ER应激下CEnCs的活力。
方法：培养人角膜内皮细胞（21T-HCEnC）并接种于384孔板，用来自天然产物文库（Enzo Screen-Well Natural Product library）的502种化合物预处理，然后经受ER应激剂衣霉素（Tunicamycin）（1μg/mL）处理24小时。使用Cell-Titer-Glo检测法测量细胞活力，有74种化合物的活力提高超过了设定的阈值（活力增加≥30%），并被选中进行进一步的剂量反应测试。进一步的剂量反应测试使用未经处理的F35T角膜内皮细胞，将其接种到384孔板中，并用每种化合物的6个对数剂量（从10 pg/mL到1 μg/mL）进行处理。处理24小时后，再次使用Cell-Titer Glo检测法测量细胞活力。在最低测试剂量（0.00001 μg/mL）下，有4种天然化合物使活力提高超过了设定阈值，其中藜芦碱（Veratrine）通过蛋白质印迹法进行了进一步分析，剂量范围从10 pg/mL到0.01 μg/mL。同时通过蛋白质印迹法测量了凋亡和未折叠蛋白反应标志物。
结果：在502种化合物（每种给药浓度为0.01 μg/mL）中，研究人员鉴定出74种化合物对衣霉素诱导的应激表现出30%或更高的21T HCEnC细胞活力保护作用。在这74种经过进一步剂量反应测试的化合物中，有4种化合物在测试的最低化合物剂量下，与基线F35T细胞的活力相比，将细胞活力提高了30%或以上。西伐丁（Cevadine），即藜芦碱，因其作为钠通道激动剂的功能及其与Na+/K+ ATP酶通道的相互作用而被选作进一步分析。用0.01 μg/mL的藜芦碱与衣霉素共同预处理，下调了裂解的半胱天冬酶9、PARP、细胞色素C、Bax和裂解的半胱天冬酶3的表达水平。对衣霉素诱导ER应激下的FECD细胞系进行的蛋白质印迹显示，经0.01 μg/mL藜芦碱预处理后，所有三条ER未折叠蛋白反应通路的标志物均减少。
结论：本研究深入了解了天然化合物在调节与许多角膜内皮相关疾病相关的ER应激介导的CEnC死亡中的作用。研究发现藜芦碱对ER应激的CEnCs具有保护作用，表现为经藜芦碱处理后凋亡信号和ER应激标志物减少，这表明其可能通过介导ER应激信号发挥作用。未来需要进一步的研究来阐明藜芦碱在FECD中的作用机制和效用。
天然化合物文库筛选鉴定藜芦碱（Veratrine）保护角膜内皮细胞免受内质网应激损伤的机制研究——论文解读
一、研究背景与科学问题
Fuchs角膜内皮营养不良（FECD）是一种进行性、退行性的角膜内皮疾病，影响全球约3亿人口。该病以角膜内皮细胞（CEnCs）丢失和称为滴状赘疣（guttae）的细胞外沉积物形成为特征，导致角膜水肿和视力丧失。目前尚无治愈方法，角膜移植仍是晚期疾病的唯一根治手段，但受限于供体组织短缺、移植失败风险及长期术后护理需求，亟需能够保存角膜内皮细胞、延缓疾病进展的药物疗法。
FECD诱导CEnCs凋亡的一个关键因素是内质网（ER）应激的持续上调及随之激活的未折叠蛋白反应（UPR）通路。尽管UPR的初始激活有助于恢复ER稳态，但长期的激活会变得适应不良，最终促进凋亡和CEnCs的进行性丢失。三条主要的UPR通路包括：激活转录因子6（ATF6）通路、肌醇需求酶1α（IRE1）通路以及蛋白激酶RNA样ER激酶（PERK）-激活转录因子4（ATF4）-C/EBP同源蛋白（CHOP）通路。既往研究表明，在FECD患者来源的角膜样本中观察到这三条UPR通路的部分激活以及凋亡标志物（如半胱天冬酶3和9）的表达。
已有研究探索了靶向ER应激在眼科疾病中的治疗潜力，例如4-苯基丁酸（4-PBA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）和水杨素（salubrinal）等化合物在实验模型中显示出保护作用。天然产物因具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和调节ER应激的特性，也在多种眼病中被广泛研究，如姜黄素、白藜芦醇、槲皮素等。然而，关于天然化合物能否保护角膜内皮细胞免受ER应激损伤的研究相对较少。基于此，本研究旨在筛选一个天然化合物文库，寻找能够保护CEnCs免受ER应激诱导损伤的候选分子，并对最有前景的化合物——藜芦碱（Veratrine）在FECD来源的细胞系中进行深入评估。
二、研究方法概述
研究人员采用了多轮筛选策略。首先，使用永生化健康人角膜内皮细胞系21T HCEnC（由哈佛大学Ula Jurkunas博士提供）进行初步筛选，细胞被接种于384孔板，用Enzo Screen-Well天然产物文库中的502种化合物（0.01 μg/mL）预处理2小时，随后加入ER应激剂衣霉素（Tunicamycin，1 μg/mL）共孵育24小时，利用Cell-Titer Glo检测法测定细胞活力。其次，对初步筛选出的74个阳性化合物进行剂量反应测试，使用未经处理的永生化FECD患者来源的角膜内皮细胞系F35T HCEnC（由约翰霍普金斯大学Albert Jun博士提供），测试6个对数浓度梯度（10 pg/mL至1 μg/mL），同样采用Cell-Titer Glo法评估活力。最后，对最有效的化合物藜芦碱进行靶向分析，通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测F35T细胞中凋亡标志物（如裂解的半胱天冬酶9、3，PARP，细胞色素C，Bax）和三条UPR通路标志物（ATF6，XBP1s，PERK，ATF4，CHOP）的蛋白表达变化。
三、主要研究结果
3.1 筛选试验标准化
在进行正式筛选前，研究人员预先优化了细胞接种密度、天然产物筛选浓度及ER应激剂衣霉素的合适浓度，并将这些参数应用于整个筛选流程。
3.2 天然产物文库的初步筛选
对502种化合物在健康21T HCEnC细胞系中进行初步筛选。结果显示，与单独衣霉素处理组相比，共有74种化合物使细胞活力提高超过30%（设定为初步阳性标准）。其中，1种化合物保护效果超过50%，14种在40-50%之间，59种在30-40%之间。
3.3 初步阳性化合物的剂量反应筛选
将74种初步阳性化合物在F35T FECD细胞系中进行第二轮剂量反应筛选。以在最低测试剂量（0.00001 μg/mL）下使细胞活力较基线提高超过30%为最终入选标准，共鉴定出4种终选化合物：大黄素（Emodin）、杜宾定（Dubinidine）、L-环丝氨酸（L-Cycloserine）和西伐丁/藜芦碱（Cevadine/Veratrine）。鉴于藜芦碱作为钠通道激动剂且与维持角膜透明度的关键离子转运体Na+/K+ ATP酶通道存在相互作用，而该泵在FECD中表达下调，因此选择藜芦碱进行后续深入分析。
3.4 藜芦碱降低FECD细胞系中线粒体凋亡标志物的表达
蛋白质印迹分析表明，在F35T细胞中，与单独衣霉素处理组相比，较高剂量的藜芦碱（0.01 μg/mL）预处理显著降低了线粒体凋亡通路相关蛋白的表达，包括：线粒体起始型半胱天冬酶（裂解的半胱天冬酶9）、促凋亡蛋白Bax、释放后启动内在凋亡通路的线粒体蛋白细胞色素C、执行型半胱天冬酶（裂解的半胱天冬酶3）以及DNA损伤传感器PARP。较低剂量的藜芦碱（0.00001和0.0001 μg/mL）则未见显著效果。
3.5 藜芦碱处理对F35T角膜内皮细胞中ER未折叠蛋白反应标志物表达的影响
蛋白质印迹结果显示，在衣霉素诱导ER应激的F35T细胞中，高剂量藜芦碱（0.01 μg/mL）预处理同样使三条UPR通路的标志蛋白表达呈下降趋势，包括ATF6（ATF6通路）、XBP1s（IRE1-XBP1s通路）以及PERK、ATF4和CHOP（PERK-ATF4-CHOP通路）。低剂量藜芦碱对此无影响。
四、讨论与结论
讨论部分总结： 本研究首次系统筛选了天然化合物文库在保护角膜内皮细胞免受ER应激损伤中的作用。最终筛选出的四种化合物（大黄素、杜宾定、L-环丝氨酸和藜芦碱）各有其已知的药理活性，其中藜芦碱虽未被研究过在眼科疾病中的应用，但其增强Na+/K+-ATP酶表达的潜力使其成为治疗FECD的候选分子，因为FECD的特征正是该泵密度显著降低。研究人员发现，高剂量藜芦碱能有效降低线粒体凋亡标志物，这与纯化的藜芦定（Veratridine）通常诱导凋亡的作用相反，推测可能与藜芦碱作为混合物毒性较低有关。由于也观察到UPR通路活化的降低，研究人员提出藜芦碱的抗凋亡效应可能继发于其对ER应激的缓解。其潜在机制可能是通过减轻氧化应激或稳定细胞内钙离子水平来实现，但研究中并未观察到钠钾泵蛋白表达的改变，具体机制有待阐明。此外，考虑到藜芦碱已被报道具有骨骼肌毒性并于近期注册为农药，未来研究必须谨慎评估其在FECD临床前模型中的安全性和治疗窗口。
结论部分翻译： 本研究发现，在筛选的502种天然化合物中，藜芦碱可能通过降低ER应激和凋亡标志物，对处于ER应激状态下的CEnCs具有保护作用。未来的研究需要在临床前模型中研究其剂量依赖的眼部安全性和耐受性，阐明其减轻CEnCs ER应激和凋亡的作用机制，并确定其在FECD中的临床疗效。
