《Frontiers in Oncology》：RNF152 promoter methylation and gene expression in oral premalignant lesions and oral squamous cell carcinoma: implications for epigenetic biomarker development
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目的：异常的启动子DNA甲基化代表口腔癌变过程中的早期分子改变，并已成为口腔癌分子生物标志物的潜在来源。尽管RNF152已被认为与癌症相关的分子失调有关，但其启动子甲基化及表达状态此前尚未在口腔癌前病变（OPML）或口腔鳞状细胞癌（OSCC）中进行过专门研究。
目的：异常的启动子DNA甲基化代表口腔癌变过程中的早期分子改变，并已成为口腔癌分子生物标志物的潜在来源。尽管RNF152已被认为与癌症相关的分子失调有关，但其启动子甲基化及表达状态此前尚未在口腔癌前病变（OPML）或口腔鳞状细胞癌（OSCC）中进行过专门研究。实验设计：研究人员在30例OSCC患者和30例OPML患者的配对病变/肿瘤组织及匹配的癌旁正常组织中评估了RNF152启动子甲基化与基因表达，同时纳入了15例健康对照的口腔黏膜组织。此外，还分析了患者队列中匹配的唾液和血清样本，以评估RNF152甲基化作为潜在液体活检标志物的价值。研究人员进行了定量甲基化特异性PCR（QMSP）和定量实时PCR（QRT-PCR），并研究了其与临床病理特征的关联、诊断效能以及启动子甲基化与基因表达之间的关系。结果：在36.7%的OSCC肿瘤组织和70.0%的OPML病变组织中检测到RNF152启动子甲基化，而在健康对照的口腔黏膜组织中未检测到启动子甲基化。在两个患者组匹配的唾液和血清样本中也检测到启动子甲基化。在33.3%的OSCC和30.0%的OPML组织中观察到RNF152表达降低。在13.3%的OSCC和30.0%的OPML患者中鉴定到甲基化相关的RNF152表达缺失。在甲基化阳性的病例中，36.4%的OSCC患者和42.9%的OPML患者观察到伴随的RNF152表达缺失。持续的启动子甲基化水平与两个队列中的组织基因表达均无显著相关性。RNF152启动子甲基化在区分OPML与健康对照方面表现出良好的判别性能（AUC = 0.867，p < 0.001），而其区分OSCC的判别性能虽具有统计学意义但较为有限（AUC = 0.683，p = 0.047）。结论：本研究首次对口腔癌前病变和口腔鳞状细胞癌中的RNF152启动子甲基化及基因表达进行了全面评估。RNF152启动子甲基化对OPML的诊断潜力大于对OSCC的诊断潜力，而其在液体活检标本中的性能有限。启动子甲基化与基因表达之间的不完全一致性表明，启动子甲基化可能在部分病例中导致RNF152下调，但并非其表达的唯一决定因素。这些发现支持进一步评估RNF152作为多标志物表观遗传学组合的候选组分，而非作为独立的诊断生物标志物。需要在更大规模的独立队列中进行验证，以确定其临床实用性。
**RNF152启动子甲基化与基因表达在口腔癌前病变及口腔鳞状细胞癌中的研究解读**
**一、研究背景与问题的提出**
头颈癌（HNC）是全球重要的健康负担，约占所有癌症病例的5%。口腔鳞状细胞癌（OSCC）是其中最常见的恶性肿瘤之一，在南亚地区尤为突出，吸烟和槟榔咀嚼是主要致病因素。尽管手术、放疗、化疗及靶向治疗不断进步，OSCC的五年总生存率仍仅为50%-60%，主要原因是多数患者在晚期才被确诊。因此，寻找能够早期检测疾病或改善分子风险分层的可靠生物标志物是重要的临床挑战。OSCC的发生发展涉及口腔潜在恶性疾病，本研究将其统称为口腔癌前病变（OPML），包括口腔白斑（OL）、口腔扁平苔藓（OLP）和口腔苔藓样异型增生（OLD）。遗传和表观遗传改变共同参与OPML的分子演进及侵袭性OSCC的形成。在众多表观遗传机制中，异常DNA甲基化是最早发生且被广泛研究的分子事件之一，特别是启动子CpG岛高甲基化常导致肿瘤抑制基因的转录沉默。基于DNA甲基化的稳定性、组织特异性以及在组织和体液中可检测性，其已成为口腔癌诊断和预后生物标志物的重要来源。
**二、研究目的与意义**
RNF152属于RING finger蛋白家族，主要作为E3泛素连接酶参与泛素介导的蛋白质降解和细胞内信号转导。已有研究报道RNF152在肺腺癌和结直肠癌等恶性肿瘤中表达异常，表明其在不同肿瘤类型中具有异质性表达和生物学作用。然而，此前尚无研究专门探讨RNF152启动子甲基化及其表达在口腔癌变过程中的状态。一项头颈鳞癌全基因组甲基化研究虽在公开数据集中识别出一个RNF152相关CpG位点，但未对其进行专门验证。本研究旨在首次全面评估RNF152启动子甲基化和基因表达在临床特征明确的OPML和OSCC队列中的状态，并结合配对的组织、唾液和血清样本，评估RNF152启动子甲基化在液体活检中的可检测性和诊断潜力。
**三、主要技术方法**
研究人员从伊斯坦布尔大学医学院耳鼻咽喉头颈外科和口腔颌面外科共纳入30例OSCC患者、30例OPML患者及15例健康对照者。健康对照为因非恶性适应症接受腭咽成形术且黏膜组织经组织病理学确认正常者。所有OSCC患者术前均未接受放化疗。样本包括病变/肿瘤组织、配对癌旁正常组织、血清和唾液。采用定量甲基化特异性PCR（QMSP）检测RNF152启动子甲基化状态，采用定量实时PCR（QRT-PCR）评估RNF152 mRNA表达水平，以ACTB作为内参基因。使用EZ DNA Methylation-Gold Kit进行亚硫酸盐转化，以SssI甲基转移酶处理的完全甲基化DNA作为阳性对照。统计分析包括Mann-Whitney U检验、Wilcoxon符号秩检验、卡方检验、Kruskal-Wallis检验、Spearman秩相关分析及受试者工作特征（ROC）曲线分析。
**四、研究结果**
**4.1 研究人群的临床病理特征**
OSCC队列共30例患者，平均年龄58.6岁，男性占73.3%，舌是最常见发病部位（33.3%），多数患者为IV期（53.3%），淋巴结转移占46.7%。OPML队列共30例患者，平均年龄52.0岁，女性占53.3%，OLP是最常见诊断（53.3%），其次为OL（26.7%）和OLD（20.0%）。健康对照组共15例，平均年龄54.7岁。
**4.2 OSCC和OPML中RNF152基因的表达**
QRT-PCR分析显示，33.3%的OSCC病例和30.0%的OPML病例中检测到RNF152表达降低，而40.0%的OSCC和36.7%的OPML显示表达升高，表明两个疾病组均存在显著的个体间异质性。与健康口腔黏膜相比，OSCC肿瘤组织RNF152表达约降低2.150倍，OPML病变组织约降低1.920倍。配对比较显示，OSCC肿瘤组织与配对癌旁正常组织之间、OPML病变组织与配对癌旁正常组织之间的RNF152表达水平均无显著差异。ROC分析显示，仅OSCC配对癌旁正常组织表达可显著区分OSCC患者与健康对照（AUC = 0.687，p = 0.043），而其他组织表达参数无显著判别能力。
**4.3 液体活检样本中RNF152表达的评估**
在OSCC组中，血清RNF152表达较健康对照轻度升高1.090倍，唾液中约降低1.380倍。在OPML组中，血清表达升高1.978倍，唾液表达升高1.310倍。ROC分析显示，仅唾液ΔCt值能够显著区分OSCC与OPML（AUC = 0.657，p = 0.037），而血清和唾液参数在区分疾病组与健康对照时均无显著判别性能。
**4.4 RNF152表达与临床病理特征的关联**
在OSCC队列中，年龄与配对癌旁正常组织中RNF152表达显著相关（p = 0.016），≤50岁患者表达较低。肿瘤复发与肿瘤组织RNF152表达显著相关（p = 0.037），复发患者表达较低。RNF152下调频率在AJCC I-IV期之间存在显著差异（p = 0.038），III期肿瘤中频率最高（80.0%）。在OPML队列中，饮酒与血清RNF152表达显著相关（p = 0.006），饮酒者血清表达较高。其他临床病理变量未发现显著关联。
**4.5 OSCC和OPML中RNF152基因的启动子甲基化**
QMSP检测显示，OSCC肿瘤组织中启动子甲基化检出率为36.7%（11/30），配对癌旁正常组织为26.7%；OPML病变组织为70.0%（21/30），配对癌旁正常组织为63.3%。健康对照口腔黏膜组织中未检测到RNF152启动子甲基化。OPML病变组织甲基化频率显著高于OSCC肿瘤组织（70.0% vs 36.7%，p = 0.003）。配对组织中甲基化水平无显著差异。ROC分析显示，病变/肿瘤组织甲基化水平可显著区分OPML与OSCC（AUC = 0.663，p = 0.030）。病变组织甲基化对OPML与健康对照具有良好判别性能（AUC = 0.867，p < 0.001），而肿瘤组织甲基化对OSCC的判别性能较有限（AUC = 0.683，p = 0.047）。
**4.6 RNF152甲基化与临床病理特征的关联**
在OSCC队列中，血清RNF152甲基化与饮酒显著相关（p = 0.021），唾液甲基化与吸烟呈临界关联（p = 0.053）。在OPML队列中，唾液RNF152甲基化与吸烟显著相关（p = 0.023）。甲基化相关的RNF152表达缺失在30.0%的OPML和13.3%的OSCC患者中鉴定到；在甲基化阳性病例中，36.4%的OSCC和42.9%的OPML患者表现伴随的表达缺失。Spearman相关分析未发现持续启动子甲基化水平与组织基因表达之间存在显著相关性。
**4.7 OPML诊断亚组中RNF152启动子甲基化和表达的分析**
在OLP亚组中，81.25%的病变组织检测到启动子甲基化，25.0%的患者表达降低。在OL亚组中，50.0%的病变组织检测到甲基化，37.5%表达降低。在OLD亚组中，66.7%的病变组织检测到甲基化，33.3%表达降低。三个亚组中，所有表达降低的患者均伴有相应病变组织的启动子甲基化，但甲基化阳性病例中仅42.9%表现表达降低。亚组间甲基化和表达参数无显著差异。亚组内的探索性分析发现了一些名义上的关联，但鉴于亚组样本量较小，应谨慎解读。
**五、讨论与结论**
本研究首次同时评估了OPML和OSCC中RNF152启动子甲基化与基因表达，并分析了匹配的液体活检标本。OPML中甲基化频率显著高于OSCC，而健康黏膜中未见甲基化，提示RNF152甲基化与病变口腔上皮相关，可能发生在口腔癌变相对早期。然而，由于研究为横断面设计而非纵向随访，较低的OSCC甲基化频率不应被解读为进展过程中甲基化丢失的证据。RNF152编码溶酶体相关RING-finger E3泛素连接酶，可通过泛素化Rheb和RagA负调控mTORC1信号通路，限制细胞生长并促进自噬，既往研究支持其在多种上皮恶性肿瘤中的肿瘤抑制功能。然而，本研究中启动子甲基化并未一致伴随转录下调，仅在部分病例中观察到甲基化相关的表达缺失，提示RNF152的转录调控具有异质性，可能涉及启动子甲基化之外的其他机制，包括染色质可及性、组蛋白修饰、转录因子活性、非编码RNA调控及克隆选择等。甲基化与表达的不完全一致性在其他基因中也有报道，强调不应仅从甲基化状态推断转录后果。在诊断性能方面，组织RNF152启动子甲基化对OPML具有良好判别能力，但对OSCC的敏感性有限，且液体活检标本中的性能均低于组织标本，提示RNF152不适合作为独立的诊断生物标志物或液体活检标志物，但可能作为多标志物表观遗传学组合的候选组分。研究局限性包括：OPML亚组样本量小、横断面设计无法评估纵向结局、缺乏独立外部验证队列、以及无法确立因果关系。总之，RNF152启动子甲基化在口腔癌前病变和恶性病变中可检出而在健康口腔黏膜中缺失，其对OPML的诊断性能优于OSCC，有限敏感性和液体活检中的中等性能不支持其作为独立诊断生物标志物，但支持将其作为多标志物表观遗传学组合的候选组分。需要在更大规模的前瞻性独立队列中验证其诊断价值，并确定其与互补甲基化标志物联合是否能改善临床性能。
