《Virologica Sinica》：Subcutaneous immunization with replication-competent live influenza virus confers durable protective immunity without respiratory pathology in mice
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目前的流感疫苗接种策略受到灭活平台安全性与减毒活疫苗免疫原性之间权衡的限制。本研究报告了一项全面的论证，即采用非减毒、具有复制能力的活流感A病毒（LIV）进行皮下（SC）免疫，可将免疫原性与致病性脱钩。研究人员利用小鼠模型证明，单次高剂量皮下免疫A/Puert
目前的流感疫苗接种策略受到灭活平台安全性与减毒活疫苗免疫原性之间权衡的限制。本研究报告了一项全面的论证，即采用非减毒、具有复制能力的活流感A病毒（LIV）进行皮下（SC）免疫，可将免疫原性与致病性脱钩。研究人员利用小鼠模型证明，单次高剂量皮下免疫A/Puerto Rico/8/34（H1N1）可针对致死性攻毒诱发无菌性肺部免疫，其效果显著优于肌肉注射（IM）递送和灭活疫苗。生物分布分析证实，病毒复制是短暂的（<7天），且严格局限于注射部位和引流淋巴结（dLNs），未发生向肺部或中枢神经系统的全身扩散。在机制层面，单细胞转录组学揭示，皮下递送触发局部I型干扰素“防火墙”，进而转变为强烈的生发中心（GC）反应，与磷酸盐缓冲液（PBS）处理的对照组相比，促进了广泛的浆细胞分化和更优的记忆B细胞形成。该免疫方案在免疫后277天仍可提供100%的保护。综上所述，这些发现确立了外周LIV接种作为一种用于下一代快速反应疫苗的高效范式。
**论文解读：皮下免疫复制感受态活流感病毒实现免疫原性与致病性的脱钩及持久保护**
**一、研究背景与科学问题**
流感A病毒（IAV）因其分节段的RNA基因组，通过表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的点突变发生持续抗原漂移，并可经基因重配导致抗原转换，引发季节性流行乃至大流行。尽管疫苗接种是减轻流感相关发病率和死亡率最有效的干预手段，但当前许可疫苗的效力常受限于疫苗株与流行株之间的抗原不匹配、高危人群免疫原性差以及疫苗诱导免疫的快速衰减，疫苗有效性（VE）通常仅在10%至60%之间。主流灭活流感疫苗（IIV）安全性良好，但其非复制特性限制了抗原持久性，常导致抗体亲和力成熟不足、CD8+ T细胞应答弱以及黏膜 IgA 诱导不佳。减毒活流感疫苗（LAIV）经鼻内（IN）接种能更接近自然感染以诱导更广泛的免疫，但存在呼吸道复制相关安全性风险，且易受成人预存免疫的中和。因此，亟需探索能够结合活病毒复制效力与非黏膜递送安全性的新型免疫策略。
**二、研究内容与总体结论**
研究人员系统评估了皮下（SC）接种非减毒、具有复制能力的活流感A病毒（LIV）的假说，即该策略能否将免疫原性与致病性脱钩。利用A/Puerto Rico/8/34（H1N1）小鼠模型，研究人员证实单次高剂量SC免疫LIV可诱导剂量依赖的保护性免疫，在致死性同源攻毒中实现完全保护与肺部病毒清除。安全性评估显示病毒复制短暂且严格局限于注射部位和引流淋巴结（dLNs），未向肺部或中枢神经系统扩散。单细胞转录组学揭示了一条从早期干扰素主导的先天抗病毒应答，向以抗原呈递和B细胞活化为核心的适应性免疫程序转变的时序性轨迹。与灭活疫苗、重组HA疫苗及肌肉注射（IM）途径相比，SC-LIV免疫在诱导中和抗体、生发中心（GC）反应、记忆B细胞形成及长期保护方面均具有显著优势。该策略为下一代快速反应流感疫苗提供了新范式。
**三、关键技术与方法**
研究人员采用六至八周龄雌性BALB/c小鼠模型，来源于GemPharmatech Co., Ltd.，实验在广州国家实验室生物安全二级动物实验室进行。主要技术方法包括：病毒生物分布分析，通过RT-qPCR定量组织中的病毒基因组拷贝数，并结合TCID50法检测感染性病毒颗粒；单细胞RNA测序（scRNA-seq），利用DNBelab C系列平台和DNBSEQ-T7测序仪，对免疫后不同时间点的dLNs细胞进行转录组分析，使用Leiden聚类和UMAP降维注释细胞类型；多色流式细胞术，定量分析髓系细胞、树突状细胞（DCs）、NK细胞、B细胞、Tfh细胞、GC B细胞、浆细胞及记忆B细胞等免疫细胞亚群变化；免疫组织化学（IHC）和H&E染色，评估组织病理学改变及NP抗原和CD138+浆细胞的分布。同时，通过微量中和（MN）实验评估血清中和抗体滴度。
**四、主要研究结果**
**1. LIV SC免疫赋予针对致死性PR8攻毒的剂量依赖性保护。** 将不同剂量（5、500、50000 LD50）的LIV经SC途径免疫小鼠，21天后以50 LD50 PR8进行攻毒。结果显示，中、高剂量SC免疫组及高剂量IM免疫组均获得完全保护，其中高剂量SC免疫组小鼠肺部病毒载量低于检测下限（LOD），且在整个观察期内无明显肺组织病理损伤，表明快速病毒清除和高效保护。
**2. LIV免疫耐受性良好，病毒基因组检测呈短暂、有限且无肺部感染。** 对SC和IM免疫小鼠进行多组织生物分布分析发现，病毒基因组仅在免疫后第3天于dLNs和脾脏等部位被低水平检出（102–103拷贝/μL），第7天起所有组织均低于LOD。肺组织均未检出感染性病毒，IHC未检测到NP抗原，组织学检查未见异常，证实LIV免疫具有良好的外周安全性，不会引起呼吸道感染或系统性病毒播散。
**3. LIV SC免疫相比灭活病毒诱导更优的同源及亚型内异源保护。** 对比活病毒与β-丙内酯灭活病毒经SC免疫后的保护效果，活病毒免疫在抵抗同源PR8攻毒和亚型内H1N1pdm09异源攻毒时均表现出更高的生存率、更低的肺部病毒载量和炎症因子水平，而H3N2免疫不能提供跨亚型保护。这表明活病毒免疫在诱导保护性免疫方面具有质的优势。
**4. 单次LIV SC免疫诱导比重组HA疫苗方案更持久的保护性免疫。** 与单剂或两剂重组HA疫苗（QrHA或MrHA）免疫相比，单次SC-LIV免疫在免疫后21、42及277天均能提供完全或更高水平的保护。在277天晚期攻毒中，LIV组生存率为100%，且dLNs中Tfh细胞、GC B细胞、浆细胞和类别转换记忆B细胞的比例显著升高，提示其通过促进持久的体液免疫应答维持长期保护。
**5. LIV SC免疫在dLNs中诱导快速而全面的细胞应答。** 流式细胞术动力学分析显示，SC免疫在免疫后第3天即显著增加dLNs中NK细胞、B细胞、髓系细胞和DCs比例，第7天激活DCs和巨噬细胞，第14天显著增加B细胞、Tfh、GC B细胞和浆细胞及IFN-γ+ T细胞，第21天检测到类别转换记忆B细胞的显著增加。相比之下，IM免疫的应答强度更低且缺少Tfh和效应T细胞激活。
**6. LIV SC免疫后dLNs的时间序列单细胞转录组图谱。** 对免疫后第0、1、3、7天的dLNs进行scRNA-seq分析（共57,891个细胞），鉴定出23种细胞类型。免疫后第1天，干扰素刺激基因（Ifih1、Ifit3、Irf7、Isg15等）和抗原加工相关通路显著富集；第3天转向以MHC II类抗原呈递和B细胞激活为主的程序；第7天，与淋巴细胞定位（Ccr7、Cxcr5）、免疫球蛋白表达（Ighm、Ighg2b、Jchain）及MHC II类分子相关的程序同时富集，提示GC相关B细胞分化状态。
**五、总结与结论**
讨论部分指出，SC-LIV免疫的保护效力呈剂量依赖性，高剂量免疫可实现完全保护且肺部病毒载量低于LOD。安全性方面，病毒复制被严格限制于注射部位和dLNs，未检测到肺部感染，但该研究仅基于单一病毒株和21天观察窗口，尚需在更多毒株和模型中进行扩展评估。机制上，SC递送在dLNs中引发从先天免疫到适应性免疫的协调程序，生发中心反应和记忆B细胞的形成是长期保护的基础。单次给药即可产生比重组HA疫苗更优的持久性，且其保护效果与抗体的质量而非单纯数量相关。研究结论认为，SC-LIV免疫通过空间限制病毒复制并保留活病毒的免疫学优势，有效地将免疫原性与致病性脱钩，实现了快速起效、肺部无菌保护及长期持久的免疫力，为应对新发和再发流感病毒的大流行防范提供了高潜力的疫苗平台。
