通过合成基因组构建的溶瘤单纯疱疹病毒在小鼠结直肠癌模型及人肿瘤细胞系中的抗肿瘤疗效

《Virology》：Anti-tumor efficacy of oncolytic herpes simplex viruses constructed by synthetic genomics in a murine colorectal carcinoma model and in human tumor cell lines

　　

摘要

结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，有效的治疗策略至关重要。溶瘤病毒在此方面具有巨大的应用前景。在先前的研究中，我们合成了两种溶瘤单纯疱疹病毒I型（oHSV-1），分别为oHSV-1.1和oHSV-1.2。两种病毒均通过删除毒力基因ICP34.5和ICP47进行减毒处理，而oHSV-1.2进一步装载了小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素-12（IL-12）以激活免疫应答。两种病毒在小鼠黑色素瘤模型中均表现出显著的抗肿瘤疗效。在本研究中，我们评估了oHSV-1.1和oHSV-1.2在免疫健全的小鼠结直肠癌模型及人肿瘤细胞系中的溶瘤潜力。oHSV-1.2在体内引起了显著的肿瘤抑制和抗肿瘤活性，表现为肿瘤消退、中性粒细胞浸润增强、特异性抗肿瘤免疫应答激活以及肿瘤组织中的显著病理损伤。此外，oHSV-1.1和oHSV-1.2均在多种人肿瘤细胞中进行了体外复制并发挥了细胞毒性作用。本研究为oHSV-1.2在结直肠癌治疗中的应用提供了有价值的见解。

引言

癌症仍然是全球主要的死因之一，并带来沉重的健康和经济负担（Sung等，2021；Qi等，2023）。在所有癌症类型中，结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症和第二大癌症相关死因（Xi和Xu，2021；Eng等，2024）。结直肠癌的发病率和死亡率在发展中国家不断上升，且不同地区的存活率差异显著，凸显了改善结直肠癌诊断和治疗的紧迫需求（Morgan等，2023；Wang等，2023a；Wu等，2025）。结直肠癌的标准治疗包括手术、放疗、化疗及多种策略的联合应用（Kumar等，2023）。然而，目前的治疗存在明显的局限性，包括疗效有限、特异性不足、肿瘤耐药性以及对治疗反应的约束，这主要源于肿瘤的异质性（Schuell等，2005；Zhou等，2021；Wang等，2023b）。因此，开发更有效的结直肠癌治疗策略是一项关键优先事项。

针对各种肿瘤类型，人们积极探索创新的癌症治疗方法，包括癌症免疫疗法、靶向治疗、抗体药物偶联物和溶瘤病毒疗法（Liu等，2024）。溶瘤病毒疗法利用选择性感染并裂解癌细胞的病毒，已成为一种新型且有前景的治疗策略（Lin等，2023；Shalhout等，2023）。在溶瘤病毒的开发过程中，使用了不同的病毒载体，包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、副黏病毒和呼肠孤病毒（Lawler等，2017；Abd-Aziz和Poh，2021；Omole等，2022）。迄今为止，已有四种复制性溶瘤病毒和一种非复制性溶瘤病毒获得临床批准用于治疗癌症（Ferrucci等，2021；Frampton，2022；Narayan等，2024）。

在不同的溶瘤病毒中，单纯疱疹病毒1型（HSV-1）以其大的基因组（允许插入治疗基因）、明确表征的生物学特性以及已确立的安全特征而著称（Su等，2024；Li和Cheng，2024；Zhou和Shen，2025）。值得注意的是，四种已获批准的复制性溶瘤病毒中有两种基于HSV-1，目前还有众多溶瘤HSV-1（oHSV-1）候选物正在研究中或处于临床试验阶段（Koch等，2020；Aldrak等，2021；Vázquez-Arreguín等，2025）。已有报道利用CRC细胞系和小鼠CRC模型进行的oHSV-1临床前研究（Kimata等，2003；Gutermann等，2006；Zhu等，2024）。此外，利用减毒野生型HSV-1治疗CRC的早期临床试验表明，该病毒可以安全地递送至肿瘤组织，并可能有助于稳定肝脏转移灶（Fong等，2009；Geevarghese等，2010）。除了oHSV-1之外，其他溶瘤病毒，包括腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒和水疱性口炎病毒，也在体外和体内被研究用于CRC治疗（Stewart等，2011；Ghorbani Alvanegh等，2023；Wang等，2025；Salameh等，2025）。

尽管oHSV-1的开发取得了显著进展，但仍需进一步修饰以增强其治疗潜力。例如，促进全身性抗肿瘤免疫对于增强溶瘤效果至关重要（Chowaniec等，2024；Ayele等，2025）。为了增强oHSV-1的全身性抗肿瘤免疫，通常将多种外源基因插入HSV-1基因组，这涉及对HSV-1基因组的多位点编辑。然而，作为大型DNA病毒，HSV-1的基因组含有倒重复序列和高G/C含量区域，使其相对难以修饰（Goldin等，1981；Perng等，1994）。合成生物学，特别是合成基因组学，为系统性修饰大型DNA病毒基因组（包括HSV-1）提供了高效的解决方案（Venter等，2022）。

在先前的研究中，我们利用合成基因组学方法合理设计并合成了HSV-1基因组。通过在Saccharomyces cerevisiae中进行转化相关重组（TAR），我们根据设计合成了HSV-1 F株的基因组片段，并转救合成病毒。具体方法是将这些片段共转染至哺乳动物细胞中（Xiao等，2024）。基于该合成平台，我们设计和合成了两种溶瘤病毒，即oHSV-1.1和oHSV-1.2（Xiao等，2025）。oHSV-1.1通过删除病毒基因ICP34.5和ICP47进行减毒；oHSV-1.2在此基础上进一步装载了小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素-12（IL-12），以增强抗肿瘤免疫激活。两种病毒均在免疫健全的小鼠黑色素瘤模型中进行了评估。结果表明，oHSV-1.1和oHSV-1.2均表现出抗肿瘤疗效，其中oHSV-1.2治疗显示出更强大的溶瘤效果，包括增强的免疫浸润、明显的肿瘤细胞凋亡以及免疫相关基因的上调（Xiao等，2025）。

在本研究中，我们在CRC模型中评估了oHSV-1.1和oHSV-1.2的溶瘤效果，包括体外和体内，以进一步表征其治疗潜力。此外，我们还调查了oHSV-1.1和oHSV-1.2在多种人肿瘤细胞系中的体外复制动力学和抗肿瘤活性。

章节摘要

细胞培养与病毒

非洲绿猴肾细胞系Vero（ATCC编号CCL-81）、人肺 carcinoma 细胞系A549（ATCC编号CCL-185）、人骨肉瘤细胞系U-2OS（ATCC编号70043381）和人肝癌细胞系Huh-7（ATCC编号PTA-4583）购自中国科学院国家病毒资源中心，并在我们的实验室中保存培养。小鼠结肠癌细胞系MC38由武汉大学张军教授惠赠。Vero、Huh-7和MC38细胞为

oHSV-1.1和oHSV-1.2在小鼠结肠癌细胞中的体外评估

图1A展示了本研究中使用的合成病毒与HSV-1 F株（F-WT）的基因组结构比较示意图。F-Syn保留了HSV-1 F株的所有病毒基因，并在UL22和UL23之间插入了二元GFP表达盒。在oHSV-1.1中，删除了两份ICP34.5和ICP47拷贝以降低病毒毒力。在oHSV-1.2中，除减毒外，mGM-CSF和mIL-12的表达盒被插入UL和US区域，

讨论与结论

尽管结直肠癌治疗取得了相当显著的进展，但仍面临相当多的治疗挑战，包括疗效有限和毒副作用（Shaham等，2025）。在某些情况下，结直肠癌被归类为免疫"冷"肿瘤，这限制了免疫治疗方法的疗效（Liu等，2023）。溶瘤病毒能够感染肿瘤细胞并在其中复制，导致直接的溶瘤作用。该过程诱导免疫原性细胞死亡，从而释放肿瘤相关抗原

CRediT作者贡献声明

肖涵（Han Xiao）：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、方法学、调查、概念构思。殷启然（Qiran Yin）：写作——审阅与编辑、方法学、调查。胡恒睿（Hengrui Hu）：写作——审阅与编辑、调查。刘佳（Jia Liu）：写作——审阅与编辑、调查。李强（Jiang Li）：写作——审阅与编辑、项目管理。胡智红（Zhihong Hu）：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、指导、基金获取、概念构思。王蔓莉（Manli

伦理声明

本研究中所有的动物实验均获得了中国科学院武汉病毒研究所机构动物护理与伦理委员会的批准（WIVA01202403）。

基金

本研究受国家重点研发计划资助（2023YFC2306600）。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争经济利益或个人关系。

致谢

感谢武汉大学张军教授惠赠MC38细胞系。感谢深圳大学先进技术研究院张先恩教授提供实验设施。感谢武汉病毒研究所核心平台和技术监督团队在组织病理学分析方面提供的技术支持。感谢武汉病毒研究所动物中心对动物实验的支持。

肖涵|殷启然|胡恒睿|刘佳|李强|胡智红|王蔓莉

中国科学院武汉病毒研究所，病毒学与生物安全重点实验室，武汉，中国 430071