《Virus Research》：In vitro and
in
silico antiviral activity of
Polyscias scutellaria leaf extract against drug-susceptible and drug-resistant herpes simplex virus and human papillomavirus-positive cervical cancer: implications for topical formulation development
编辑推荐：
单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）和人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染持续构成重大全球健康负担。研究人员旨在评估新鲜及干燥的Polyscias scutellaria叶提取物及含该提取物的原型
单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）和人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染持续构成重大全球健康负担。研究人员旨在评估新鲜及干燥的Polyscias scutellaria叶提取物及含该提取物的原型草药皂对HSV、HPV-16假病毒（Psv16）及HPV-16/18阳性宫颈癌细胞的抑制作用，并通过代谢组学与计算机模拟方法初步探索其活性物质基础。采用MTT法测定细胞毒性，空斑抑制实验评估抗HSV活性，Psv16感染模型评价抗HPV-16作用，AO/EB双染与流式细胞术检测细胞凋亡，qPCR检测病毒及细胞基因表达，Western blot检测HSV-1 gC蛋白，ESI-QTOF-MS进行代谢物谱分析，分子对接预测关键代谢物与病毒靶蛋白的结合亲和力。结果显示，新鲜叶乙醇提取物（FET）在亚毒性浓度下对ACV耐药HSV-1 dxpIII的选择指数（SI）达240.39，显著高于阿昔洛韦（ACV）的26.38；FET在病毒吸附、穿透及释放阶段均表现出抑制作用，并可下调HSV-1 ICP4、UL30、US6 mRNA及gC蛋白表达。FET还可抑制Psv16感染，诱导CaSki和HeLa细胞凋亡，下调HPV-16/18 E6、BCL2及NFKB1 mRNA，同时上调BAX表达。含FET的草药皂在1×和0.75×配方下均可抑制耐药HSV-1感染并降低HPV-16/18 E6表达。代谢组学分析鉴定出1,743种（正离子模式）和664种（负离子模式）推定代谢物，其中cinchonine和aphyllic acid对HSV-1 gD、HSV-1 DNA聚合酶、HPV-16 L1和HPV-16 E6表现出较优的预测结合亲和力。多数候选化合物具有良好类药性和较低预测毒性。上述结果表明，P. scutellaria叶提取物，尤其是FET，具有开发为抗HSV和抗HPV相关宫颈癌局部制剂的潜力，但需进一步体内及安全性研究验证。
**论文解读：Polyscias scutellaria叶提取物抗HSV与HPV感染的体外及计算机模拟研究**
**1. 研究背景与问题**
病毒性传染病持续构成全球重大健康威胁。单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）和人类乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染广泛流行：全球50岁以下人群中约38亿（64%）感染HSV-1，约5.2亿人感染HSV-2；HPV感染则导致全球约4.5%的癌症病例，其中宫颈癌在2022年新发病例约66万例，死亡约35万例。当前HSV感染的标准治疗药物阿昔洛韦（acyclovir, ACV）频繁使用可导致耐药株出现，在免疫功能低下患者中尤为突出；而现有HPV预防性疫苗对已感染人群无治疗作用，且在中低收入国家覆盖率不足。因此，寻找针对耐药HSV和已确立HPV感染及其相关病变的替代或补充治疗策略具有重要临床意义。
**2. 研究目的与意义**
本研究旨在系统评估新鲜和干燥的Polyscias scutellaria叶提取物（水提和醇提）对药物敏感及耐药HSV、HPV-16假病毒（pseudovirus, Psv16）和HPV-16/18阳性宫颈癌细胞（CaSki、HeLa）的抑制作用，并通过代谢物谱分析、分子对接、毒理预测等手段初步阐明其活性物质基础，同时制备含提取物的原型草药皂，评估其作为局部外用制剂的可行性。这是首次报道P. scutellaria对耐药HSV和HPV感染具有抑制活性的研究。
**3. 关键技术方法**
研究人员采用以下主要技术：（1）空斑抑制实验评价抗HSV活性（包括吸附前、宿主细胞受体结合、病毒吸附、穿入、释放及药物处理时间等阶段）；（2）293FT细胞包装HPV-16假病毒并感染模型评价抗HPV-16活性；（3）MTT法测定细胞毒性，AO/EB双染和流式细胞术检测细胞凋亡，划痕实验评价细胞迁移；（4）RT-qPCR检测病毒基因（HSV-1 ICP4、UL30、US6，HPV-16/18 E6）及细胞凋亡相关基因（BAX、BCL2、NFKB1）表达，Western blot检测HSV-1 gC蛋白；（5）ESI-QTOF-MS非靶向代谢组学分析提取物中推定代谢物；（6）分子对接技术预测代谢物与HSV-1 gD、HSV-1 DNA聚合酶、HPV-16 L1和HPV-16 E6的结合亲和力，并结合SwissADME和ProTOX 3.0预测类药性和毒性。细胞系包括CaSki（HPV-16阳性宫颈癌）、HeLa（HPV-18阳性宫颈癌）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、293FT（人胚胎肾细胞）；病毒株包括HSV-1 KOS（药物敏感）、HSV-2临床分离株、HSV-1 dxpIII（磷酸乙酸和膦甲酸耐药株）。
**4. 主要研究结果**
**4.1 抗HSV感染活性**：在感染后进入阶段，所有提取物均剂量依赖地抑制三种HSV毒株。新鲜叶乙醇提取物（FET）对耐药HSV-1 dxpIII的选择指数（selectivity index, SI）最高达240.39，远高于ACV（26.38）。FET在吸附前阶段显著抑制HSV-1 dxpIII，并在病毒吸附、宿主细胞受体结合、穿入及释放阶段均表现出抑制作用；连续处理4小时即可显著减少空斑形成，且在病毒感染后16小时加药仍能抑制空斑形成，效果优于ACV。FET还可显著下调HSV-1 ICP4、UL30、US6 mRNA及gC蛋白表达，提示其通过抑制即刻早期基因表达而阻断病毒复制周期。
**4.2 抗HPV-16假病毒感染**：FET和FW在0.1 mg/mL浓度下于吸附前阶段显著抑制Psv16感染，但吸附阶段无效，与阳性对照葡聚糖（dextran）类似，表明其作用于病毒感染的早期进入环节。
**4.3 对HPV阳性宫颈癌细胞的作用**：FET呈剂量依赖性地诱导CaSki和HeLa细胞死亡和凋亡，0.5 mg/mL处理48小时可显著升高早期凋亡和晚期凋亡细胞比例，并抑制细胞迁移。FET可下调HPV-16/18 E6 mRNA以及细胞抗凋亡基因BCL2和NFKB1的表达，同时上调促凋亡基因BAX；在亚毒性浓度（0.125和0.25 mg/mL）下仍能降低E6表达，排除了细胞毒性造成的影响。HeLa细胞中前胱天蛋白酶-3（pro-caspase-3）表达下降，提示其被剪切活化为cleaved caspase-3。
**4.4 含FET原型草药皂的活性**：1×和0.75×两种草药皂配方（含FET，稀释至5×10??和1×10?3）在病毒吸附前和感染后阶段均显著抑制HSV-1 dxpIII空斑形成，并显著降低CaSki和HeLa细胞中HPV-16/18 E6 mRNA表达。
**4.5 生物活性成分分析**：FET具有最高的总酚含量（35.97±0.73 mg GAE/g）和较高的总黄酮含量（2.51±0.19 mg QE/g），DPPH自由基清除活性最强（72.34%±0.54%）。ESI-QTOF-MS共鉴定出正离子模式1,743种和负离子模式664种推定代谢物；正离子模式下主要superclass为有机杂环化合物（31.43%）和有机酸及其衍生物（23.80%），负离子模式下为脂质和类脂分子（32.08%）及有机酸及其衍生物（27.82%）。
**4.6 分子对接与成药性预测**：在丰度最高的20种代谢物中，cinchonine（-7.2 kcal/mol）和aphyllic acid（-6.6 kcal/mol）对HSV-1 gD的Leu220残基（位于nectin-1结合表面）表现出预测结合；两者还可与HSV-1 DNA聚合酶活性位点的Leu721、Tyr722、Asp888残基结合，以及与HPV-16 L1的Thr266（肝素结合口袋）和HPV-16 E6的Arg129（LXXLL肽结合口袋）相互作用。绝大多数候选化合物具有良好水溶性、高胃肠道吸收且无血脑屏障透过性，ProTOX 3.0预测毒性多为4级（仅吞入有害），提示其作为局部外用制剂具有相对较低的预测毒性。
**5. 讨论与结论**
本研究首次证明P. scutellaria提取物对药物敏感和耐药HSV均具有抗病毒活性，其中FET对ACV耐药HSV-1效果突出。FET的抗病毒机制可能涉及多个阶段，包括阻断病毒吸附、穿入、释放以及抑制病毒基因表达。在HPV相关方面，FET既能抑制HPV-16假病毒感染，又能通过调节凋亡相关基因诱导HPV阳性宫颈癌细胞凋亡，并降低病毒癌基因E6表达。含FET的草药皂制剂在细胞水平上保留了抗病毒和抑制E6表达的活性，支持其作为局部外用制剂进一步开发的可能性。分子对接结果提示cinchonine和aphyllic acid可能是重要的活性代谢物，但这些计算机预测仅提供初步机制假设，需实验验证。研究局限性包括：使用非人源Vero细胞系评价抗HSV活性；原型肥皂缺乏皮肤、黏膜或眼表刺激性评估；所需有效浓度较高（mg/mL级）；代谢物鉴定为推定注释，需标准品确证。总体而言，P. scutellaria新鲜叶乙醇提取物具有开发为抗HSV、抗HPV及HPV相关宫颈癌辅助治疗或预防性局部制剂的潜力，但需后续体内外安全性、有效性和配方优化研究支持。
研究结论：P. scutellaria新鲜叶乙醇提取物（FET）在体外显著抑制药物敏感和耐药HSV-1感染，抑制HPV-16假病毒感染，并通过调节凋亡相关基因诱导HPV-16/18阳性宫颈癌细胞凋亡；含FET的原型草药皂具有抑制耐药HSV-1感染和降低HPV-16/18 E6表达的活性；代谢物谱分析联合分子对接预测cinchonine和aphyllic acid可能通过与病毒关键蛋白结合参与上述活性，且多数代谢物预测毒性较低、类药性良好。这些发现支持FET作为局部外用制剂用于HSV和HPV相关疾病防治的潜在价值。
