《Digital Discovery》：Molecular docking versus co-folding for protein–peptide pose prediction: effects of protein flexibility and training set overlapOpen Access
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合成肽因其高特异性、易于合成以及适用于靶向蛋白质界面，作为治疗和诊断制剂日益重要。然而，准确预测肽结合构象仍是一个重大挑战，特别是对于构象灵活的蛋白质靶点和从头设计的肽。基于深度学习的共折叠方法，包括AlphaFold-Multimer（AFM）、AlphaF
合成肽因其高特异性、易于合成以及适用于靶向蛋白质界面，作为治疗和诊断制剂日益重要。然而，准确预测肽结合构象仍是一个重大挑战，特别是对于构象灵活的蛋白质靶点和从头设计的肽。基于深度学习的共折叠方法，包括AlphaFold-Multimer（AFM）、AlphaFold3（AF3）和Boltz-2，通过同时预测蛋白质-肽复合物结构，无需预先定义结合构象，为传统肽对接提供了一种替代方案。在本研究中，研究人员使用PepPro数据集，将这三种共折叠方法与两种针对肽优化的分子对接方法AutoDock-CrankPep（ADCP）和HADDOCK进行了系统基准测试。该成熟数据集包含构象灵活的蛋白质-肽复合物，这些复合物存在于所有共折叠方法的训练集中。为了评估共折叠方法的泛化性能，研究人员构建了一个独立测试集，并根据其与训练集的冗余水平进行分类。基准测试结果表明，当相关复合物存在于训练集中时，共折叠方法在构象预测准确性和排序性能方面优于对接方法。然而，在没有此类表示的情况下，HADDOCK优于所有评估的共折叠方法。Boltz-2在PepPro数据集上取得了最高准确性，但在非冗余复合物上泛化能力降低，表明其对训练集覆盖度的强烈依赖。相比之下，AFM和AF3表现出更稳健的泛化能力，并在独立的蛋白质-肽复合物上保持了一致的性能，突显了它们更适合从头肽结合物设计。此外，对评分指标的广泛分析显示，界面预测模板建模（ipTM）提供了强大的早期富集性能，而肽特异性预测局部距离差异测试（pLDDT）与结构准确性密切相关，表明它们在候选优先级排序中具有互补价值。这些发现表明，稳健的肽结合物预测需要仔细考虑训练集冗余、靶标构象灵活性以及互补的置信度指标，以选择从头候选优先级排序的计算方法。
蛋白-肽构象预测是计算结构生物学的重要挑战，尤其是当蛋白质靶点具有构象柔性或肽为从头设计时。合成肽因其高特异性和易于合成成为治疗和诊断的重要分子，但准确预测其结合构象仍依赖计算方法的进步。传统分子对接（molecular docking）通常基于静态蛋白结构，难以应对apo到holo的构象变化。近年来，基于深度学习的共折叠（co-folding）方法如AlphaFold-Multimer（AFM）、AlphaFold3（AF3）和Boltz-2，直接从序列预测复合物结构，不需要预定义结合构象，为肽构象预测提供了新途径。然而，这些方法高度依赖训练集，可能存在数据泄漏，其在柔性靶标和全新肽上的泛化能力尚未被系统评估。为此，研究人员系统比较了三种共折叠方法与两种优化肽对接方法——AutoDock-CrankPep（ADCP）和HADDOCK——在构象柔性基准和独立测试集上的性能。
研究人员使用了PepPro数据集（包含57个构象柔性蛋白-肽复合物，对应有apo结构）和构建的独立测试集（57个外部复合物，按结构与训练集冗余程度分类）。评估指标包括DockQ、Spearman ρ、Kendall τ、ROC-AUC、PR-AUC和BEDROC。结论显示，共折叠方法在训练集有相关数据时占优，但HADDOCK在非冗余数据上胜出；Boltz-2在熟悉数据上最强，但泛化能力弱于AFM和AF3；ipTM和肽pLDDT具有互补价值。
关键技术方法方面，研究团队从Zou实验室网站获取PepPro数据集；独立测试集来自RCSB PDB，选取2023年6月1日后释放的5-30残基肽复合物，经TM-align聚类（TM-score≥0.9）和冗余分类构建。对接方法中，ADCP使用CRANKITE蒙特卡洛采样和Go型势函数；HADDOCK采用信息驱动对接并允许有限柔性。共折叠方法中，AFM采用不变点注意力网络，AF3和Boltz-2为扩散模型，Boltz-2还包括物理启发的“Boltz-steering”机制。所有方法均生成多个模型并用内部置信度指标排序。评估使用DockQ分类构象质量，并通过自举重采样估计95%置信区间。
结果部分，首先，独立测试集中的大多数复合物与训练集无或低冗余：结构冗余分析显示57个复合物中，11个受体无训练集同源结构，27个低肽界面泄漏，仅有2个高度泄漏，表明独立集能有效检验泛化能力。其次，基准数据集主要包含进化远缘蛋白质：系统发育分析显示多数蛋白质序列距离大于1替换/位点，仅有少数相同蛋白对，且性能与进化距离无关。第三，共折叠方法在构象柔性蛋白质上优于对接：在PepPro上，共折叠方法在中等和高构象变化类别中成功率更高，而ADCP产生大量错误预测，HADDOCK在可接受质量上接近共折叠。第四，共折叠构象预测质量在非冗余复合物上大幅下降：在独立数据上，HADDOCK以82.5%的高质量top-3成功率超越所有方法，而共折叠方法在非冗余子集上的中等质量成功率降至33-48%，高质量降至10-30%，其中AFM泛化最强，Boltz-2下降最大。第五，共折叠方法在排序性能上优于对接：在PepPro上，Boltz-2的复合物ipLDDT和置信度分数达到最高PR-AUC（0.92）和BEDROC（0.99），AFM的肽pLDDT相关性最高（Spearman ρ=0.73），而ADCP评分为负相关且无富集。第六，AlphaFold架构在独立数据集上表现更佳，Boltz-2性能下降：在独立数据上，AFM和AF3的ipTM和肽pLDDT相关性提高，而Boltz-2的置信度分数相关性降低，肽pLDDT成为其最佳指标。
讨论部分指出，Boltz-2的优势源于其更宽的训练集截止日期（2023年6月），但这也导致对训练数据更强的依赖。AFM和AF3在非冗余复合物上更稳健，更适合从头肽设计。HADDOCK在有实验apo/holo结构时具有实用价值，可与共折叠方法互补。ipTM在早期富集上表现突出，而肽pLDDT与结构准确性强相关，两者结合可提高候选优先级排序。研究局限性包括独立测试集缺少apo结构，无法完全区分数据泄漏与构象变化的影响。结论翻译为：本研究表明，共折叠性能在非冗余复合物上大幅下降，尤其是缺乏肽信息时；然而，共折叠方法在处理明显apo-holo构象变化时优于对接方法；肽特异性pLDDT与结构准确性强相关，并补充ipTM以支持稳健排序和早期富集；计算方法和排序指标的选择应与研究目标一致，以支持稳健的肽设计。
