《Frontiers in Pharmacology》：Benzyl isothiocyanate alleviates neural damage in experimental autoimmune uveitis by modulating the TREM-1/PI3K/AKT signaling pathway
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目的：探讨苯甲基异硫氰酸酯（Benzyl isothiocyanate，BITC）是否能改善实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU），并探索其潜在机制。方法：为评估BITC的治疗效果，通过免疫C57BL
目的：探讨苯甲基异硫氰酸酯（Benzyl isothiocyanate，BITC）是否能改善实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU），并探索其潜在机制。方法：为评估BITC的治疗效果，通过免疫C57BL/6小鼠与IRBP651-670诱导EAU模型。采用临床评分和组织病理学染色评估疾病严重程度。通过伊文思蓝染色和Western blot分析评估血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的完整性。采用尼氏染色、Brn3a免疫荧光和TUNEL实验评估视网膜神经元损伤。在体外，将BV2细胞暴露于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）。检测氧化应激的生化标志物、吞噬相关标志物的mRNA水平、神经营养因子的蛋白和mRNA水平，以及髓样细胞触发受体-1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）。此外，将BV2细胞的条件培养基与原代视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）共培养以检测细胞凋亡。通过过表达TREM-1（oe-TREM-1）评估TREM-1在BITC保护作用中的功能相关性。结果：在体内，BITC减轻了EAU小鼠的临床症状。治疗显著维持了BRB的完整性，并减轻了氧化应激和神经元损伤。在体外，BITC抑制了氧化应激和吞噬活性。BV2细胞与原代RGCs的共培养研究表明，BITC可减轻LPS + IFN-γ诱导的原代RGCs损伤并抑制细胞凋亡。此外，BITC下调了EAU小鼠和LPS + IFN-γ诱导的BV2细胞中TREM-1/PI3K/AKT信号通路的表达。oe-TREM-1部分消除了BITC对氧化应激和吞噬作用的抑制效应，也削弱了其对神经元损伤的保护作用。结论：BITC通过下调TREM-1/PI3K/AKT信号通路、减少氧化应激和过度吞噬、促进神经营养因子分泌，从而减轻EAU中的神经损伤。
**论文解读：BITC通过TREM-1/PI3K/AKT通路缓解EAU神经损伤的研究**
**一、研究背景与问题**
自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis，AU）是一类由免疫细胞和炎症介质介导的慢性复发性炎症性疾病，可累及眼内组织，严重时可导致视力丧失。实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）模型被广泛用于研究慢性葡萄膜炎的发病机制和治疗策略。在EAU中，活化的免疫细胞破坏血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB），引起视网膜组织损伤和严重视力下降。小胶质细胞是介导葡萄膜炎发生发展的关键细胞。活化的小胶质细胞释放大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎症细胞因子，激活核因子κB（nuclear factor κ-B，NF-κB）信号通路，加剧BRB破坏并诱导组织氧化损伤。在炎症微环境中，过度极化的促炎性小胶质细胞丧失分泌脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）的能力，并可能表现出异常吞噬行为，破坏视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的功能突触，导致神经功能障碍。髓样细胞触发受体-1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）主要表达于小胶质细胞、单核/巨噬细胞和中性粒细胞，其激活可协同Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）放大炎症反应。TREM-1与DNAX激活蛋白12（DAP12）结合后可激活下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路，异常表达常驱动过度炎症损伤。苯甲基异硫氰酸酯（Benzyl isothiocyanate，BITC）是从十字花科植物中提取的天然活性化合物，具有显著的抗炎和抗氧化活性。已有研究表明BITC可通过PI3K/Akt/NF-κB通路调节炎症反应，并改善糖尿病小鼠的氧化应激和肝功能。然而，BITC对AU是否具有治疗作用尚不清楚。因此，本研究旨在探讨BITC对EAU的治疗潜力及其潜在机制。
**二、研究内容与结论**
研究人员采用EAU小鼠模型、LPS和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）诱导的BV2细胞炎症模型以及BV2-原代RGCs共培养系统，系统评估了BITC的治疗作用。研究发现，BITC治疗显著改善了EAU小鼠的临床症状，维持了BRB完整性，减轻了视网膜炎症和氧化应激，并抑制了小胶质细胞的过度激活和异常吞噬功能。在体外，BITC抑制了LPS + IFN-γ诱导的BV2细胞炎症、氧化应激和吞噬活性，并通过调节BV2细胞分泌功能间接减轻了原代RGCs的凋亡。机制研究表明，BITC下调了TREM-1/PI3K/AKT信号通路的表达；过表达TREM-1可部分逆转BITC的抗氧化、抗吞噬及神经保护作用。这些发现表明BITC可能通过TREM-1介导的信号通路缓解EAU的疾病进展和神经炎症，为EAU的干预提供了新的候选分子和研究方向。
**三、主要关键技术方法**
本研究使用C57BL/6小鼠（6–8周龄，购自济南朋悦公司），通过皮下注射IRBP
651-670乳剂并腹腔注射百日咳毒素诱导EAU模型，于免疫后第7天开始给予BITC（20 mg/kg/天）治疗，以地塞米松（DEX）作为阳性对照。主要技术方法包括：临床评分和裂隙灯显微镜观察眼前节炎症；苏木精-伊红（H&E）染色和组织病理学评估视网膜结构；伊文思蓝（EB）染色和Western blot检测BRB完整性及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达；尼氏染色、Brn3a免疫荧光和TUNEL染色评估视网膜神经元损伤和凋亡；ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平；流式细胞术检测ROS；生化试剂盒检测谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平；RT-qPCR检测吞噬标志物CD11b、CD68和神经营养因子mRNA水平；Western blot检测TREM-1、PI3K/AKT通路、凋亡相关蛋白及BDNF/NGF蛋白表达；BV2细胞与原代RGCs的间接共培养实验（条件培养基）；TREM-1过表达质粒（oe-TREM-1）转染进行功能验证。
**四、研究结果**
**3.1 BITC改善了EAU小鼠的临床症状**
通过裂隙灯观察和临床评分发现，EAU组小鼠出现严重角膜水肿、睫状体充血和炎症细胞浸润，而BITC和DEX治疗组症状明显减轻，临床评分显著降低。H&E染色显示EAU组视网膜结构紊乱、光感受器细胞层折叠，BITC和DEX治疗恢复了视网膜形态。Iba-1免疫荧光染色显示EAU组小胶质细胞广泛激活，呈现阿米巴样形态，而BITC治疗抑制了小胶质细胞过度激活。
**3.2 BITC改善了EAU小鼠的视网膜炎症、屏障破坏和氧化应激**
ELISA结果显示，EAU组视网膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高，BITC治疗后显著降低。EB染色显示EAU组视网膜血管明显渗漏，BRB完整性破坏，而BITC治疗减少了血管渗漏。Western blot结果证实EAU组ZO-1和Occludin蛋白表达下调，BITC上调了这两种紧密连接蛋白的表达。此外，EAU组视网膜总GSH含量和SOD活性显著下降，BITC治疗使其恢复至接近对照组水平，表明BITC增强了视网膜抗氧化能力。
**3.3 BITC减轻了EAU小鼠的视网膜神经元损伤和凋亡**
TUNEL染色显示EAU组全视网膜广泛出现凋亡细胞，尤其在内核层（INL）和神经节细胞层（GCL）明显，BITC治疗显著减弱了这些区域的凋亡荧光强度。尼氏染色显示EAU组视网膜神经元水肿、尼氏体数量减少且分布稀疏，BITC治疗部分恢复了神经元密度和尼氏体分布。Brn3a免疫荧光染色显示EAU组RGCs数量显著减少，BITC治疗增加了Brn3a阳性细胞数量。Western blot检测显示EAU组BDNF和NGF蛋白表达显著下调，BITC治疗显著上调了这两种神经营养因子的表达。
**3.4 BITC抑制了BV2细胞的炎症、氧化应激和吞噬活性**
体外实验中，LPS + IFN-γ刺激BV2细胞后，IL-1β、IL-6和TNF-α分泌显著增加，ROS产生增多，GSH和SOD水平降低，同时吞噬能力显著增强（平均每细胞吞噬7.7±0.9个微球），吞噬标志物CD11b和CD68 mRNA表达上调。BITC预处理显著降低了炎症因子水平，减少了ROS产生，恢复了GSH和SOD水平，并将吞噬微球数量降至每细胞3.5±0.3个，同时下调了CD11b和CD68 mRNA表达。
**3.5 BITC在体外减少了原代RGCs的凋亡**
LPS + IFN-γ刺激BV2细胞后，BDNF和NGF的蛋白及mRNA水平均显著下降，BITC处理有效逆转了这种抑制。将不同条件培养基（CM）作用于原代RGCs后发现，CMLPS+IFN-γ显著降低RGCs活力并增加LDH释放，而CMBITC处理显著提高了RGCs存活率并减少LDH释放。Western blot显示CMLPS+IFN-γ增加了Cleaved-Caspase3/Caspase3比值和Bax/Bcl-2比值，CMBITC处理逆转了这些凋亡相关蛋白的变化。TUNEL染色进一步证实CMBITC减少了RGCs的凋亡。值得注意的是，BITC直接作用于原代RGCs并不能改善其生存率，表明BITC的神经保护作用是间接通过调节BV2细胞功能实现的。
**3.6 BITC调控了TREM-1/PI3K/AKT信号通路**
Western blot结果显示，EAU小鼠视网膜组织中TREM-1蛋白水平较对照组显著升高，BITC治疗有效抑制了TREM-1表达。在BV2细胞中，LPS + IFN-γ刺激显著上调TREM-1蛋白和mRNA表达，BITC处理逆转了这一效应。进一步检测PI3K/AKT通路发现，EAU小鼠视网膜中p-PI3K和p-AKT水平明显升高，BITC治疗后磷酸化水平显著降低。体外实验中BITC同样抑制了LPS + IFN-γ诱导的BV2细胞p-PI3K和p-AKT水平升高。
**3.7 TREM-1是BITC保护效应功能相关的介质**
通过转染oe-TREM-1过表达TREM-1后，BV2细胞中TREM-1 mRNA水平上调近两千倍，蛋白水平约上调两倍。在过表达模型中，PI3K/AKT通路进一步激活，BITC对通路磷酸化的抑制作用显著减弱。oe-TREM-1进一步降低了GSH和SOD水平，同时增加CD68和CD11b表达，增强了吞噬活化，并部分抵消了BITC的抗氧化和抗吞噬作用。此外，oe-TREM-1加重了LPS + IFN-γ诱导的BDNF和NGF下调，部分阻断了BITC对神经营养因子的上调作用。这些结果表明BITC的抗氧化、抗吞噬及促神经营养因子分泌作用与其抑制TREM-1/PI3K/AKT通路密切相关。
**五、讨论总结与结论**
研究证实BITC能够缓解EAU的疾病进展，其保护作用与保护BRB完整性、减轻视网膜氧化应激损伤、抑制小胶质细胞过度活化及异常吞噬功能有关。体内外实验结果共同表明，BITC可减轻EAU小鼠的视网膜神经元损伤和凋亡。机制上，BITC通过下调TREM-1并抑制PI3K/AKT信号通路发挥保护作用，oe-TREM-1部分逆转了BITC的保护效应，进一步确认了TREM-1在其中的关键调控作用。研究局限性在于：BV2细胞体外模型不能完全模拟原代视网膜小胶质细胞的表型；LPS + IFN-γ刺激不能完全复制EAU中T细胞驱动的复杂免疫网络；缺乏TREM-1功能缺失实验的交叉验证；神经保护证据主要基于结构和分子水平，缺乏视觉功能评估。未来研究将使用原代视网膜小胶质细胞、更接近疾病免疫微环境的刺激条件、TREM-1敲低/敲除实验，以及电生理和视觉行为学测试进一步验证。综上所述，本研究证明BITC通过抑制TREM-1/PI3K/AKT信号通路减轻EAU中BRB破坏、氧化应激和神经元损伤。BITC作为一种天然活性化合物，可能通过调节TREM-1/PI3K/AKT通路发挥治疗潜力，为EAU的干预提供了新的候选分子和研究方向。
