《Frontiers in Microbiology》：Application and evaluation of nanopore targeted sequencing in the detection of bacterial and fungal pathogens in leukemia bloodstream infectionsa
编辑推荐：
目的：评估微生物纳米孔靶向测序技术对白血病患者病原微生物的诊断性能及临床影响。方法：本回顾性观察研究招募了206例患者，以研究纳米孔靶向测序在感染病原体识别中的有效性，并将其检测性能与血培养进行比较。结果：纳米孔靶向测序的阳性率显著高于血培养[62.62%
目的：评估微生物纳米孔靶向测序技术对白血病患者病原微生物的诊断性能及临床影响。方法：本回顾性观察研究招募了206例患者，以研究纳米孔靶向测序在感染病原体识别中的有效性，并将其检测性能与血培养进行比较。结果：纳米孔靶向测序的阳性率显著高于血培养[62.62%（129/206例）对3.88%（8/206例）]。与血培养相比，纳米孔靶向测序的阳性符合率和阴性符合率分别为87.50%（95%CI：47.35–99.68%）（8例中7例）和38.38%（95%CI：31.52–45.60%）（198例中76例）。纳米孔靶向测序诊断血流感染的灵敏度为65.32%（95%CI：56.21–73.69%）（81/124），显著高于血培养[6.45%（95%CI：2.84–12.13%）（8/124）]，P < 0.001。纳米孔靶向测序的特异度为41.46%（95%CI：30.17–53.52%）（34/82），血培养的特异度为[100%（95%CI：95.56–100.00%）（82/82）]。32例受试者（24.81% [32/129]）的用药方案因纳米孔靶向测序结果而调整。在206例受试者中，29例根据纳米孔靶向测序结果调整用药的患者临床结局改善。结论：纳米孔靶向测序提高了病原体检测率，但特异度较低，可作为白血病血流感染的辅助诊断方法。
## 论文解读
### 一、研究背景与目的
白血病是临床常见的造血系统恶性肿瘤，由造血干细胞中白血病细胞异常增殖所致，严重影响造血系统正常功能并最终导致多组织器官损伤。近年来，随着医疗技术进步，血液系统恶性肿瘤的治疗方法不断更新，但血流感染作为常见并发症，其诊疗仍面临诸多挑战。感染性休克在血液系统恶性肿瘤患者中常见且死亡率高。接受免疫抑制药物及新型靶向分子治疗的患者面临更复杂病原体感染的风险，长期使用广谱抗生素会增加多重耐药菌感染风险。传统血培养方法虽可在一定程度上帮助判断血流感染，但检测周期长、灵敏度有限，感染患者中通过血培养记录的不足15%。由于免疫缺陷白血病患者的血流感染可迅速进展为呼吸和循环衰竭，需作为医疗紧急情况进行及时抗生素干预。传统微生物学方法如血培养或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在血流感染诊断中依赖血培养增菌，受灵敏度低、检测范围窄或周转时间长等限制。因此，迫切需要更快速、灵敏的检测技术。纳米孔靶向测序作为新型分子生物学技术在血流感染诊断中日益受到关注。本研究旨在通过回顾性、单中心诊断性观察研究，比较纳米孔靶向测序与常规方法在临床诊断为血流感染的血液病患者中的检测结果，评估纳米孔靶向测序作为临床血液病合并血流感染患者病原体识别的能力，并与血培养和临床诊断实时比较，评价其诊断性能和临床影响，为临床提供更可靠、快速的诊断方法。
### 二、研究设计与方法
本研究为回顾性、单中心诊断性观察研究，经武汉大学人民医院伦理委员会批准。研究招募了2021年11月至2023年10月期间246例参与者进行筛查，最终206例参与者入组并完成研究。纳入标准为经血液学检查和骨髓分析确诊为白血病（包括急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病）且伴有明显感染体征的住院患者，每例患者仅贡献一次感染事件。排除标准包括合并其他严重基础疾病或活动性严重感染以及既往确诊自身免疫疾病者。
关键技术方法主要包括以下几个方面。血培养采用BD Bactec树脂需氧瓶和/或含溶血素的厌氧瓶/儿童瓶进行微生物培养，阳性标本接种血琼脂平板和万古霉素琼脂平板，置于35℃、5% CO?培养箱中培养72-120小时，采用Bruker基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪进行快速鉴定并行药敏试验。纳米孔靶向测序采用基于扩增子的靶向测序病原体面板，对同一标本的16S rRNA基因和ITS1/2扩增产物按质量比10:3混合，使用Nanopore连接测序试剂盒构建文库，在Oxford Nanopore GridION X5平台上采用R9.4.1流动池进行测序。生物信息学分析使用Guppy进行碱基识别和质量过滤，Porechop去除接头和条形码序列，BLASTn比对16S rDNA/ITS数据库，Medaka生成共有序列并与参考数据库比对。病原判定标准包括过滤密切相关微生物、过滤阴性对照污染物并参考临床病原体列表，最终报告由临床微生物学专家和责任临床医生逐例讨论确定。统计分析方法采用复合临床诊断作为诊断准确性的参考标准，建立2×2列联表计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，并以血培养为微生物学比较器计算阳性符合率和阴性符合率，McNemar检验用于配对比例比较，95%CI采用精确二项法估计。
### 三、研究结果
3.1 患者特征：206例参与者中位年龄57岁，男性占49.03%，队列主要包括急性髓系白血病[166例（80.58%）]、慢性髓系白血病[7例（3.40%）]、急性淋巴细胞白血病[19例（9.22%）]和慢性淋巴细胞白血病[14例（6.80%）]。124例患者临床诊断为血流感染，8例血培养阳性，198例血培养阴性，总死亡率为3.40%（7/206），均在28天内死亡。血流感染与非血流感染患者的常规实验室检测指标（中性粒细胞计数、血红蛋白、血小板计数、降钙素原、C反应蛋白和白细胞计数）无显著差异。
3.2 纳米孔靶向测序相对血培养的性能：纳米孔靶向测序检测周转时间小于19小时，电子报告通常在24小时内发送给临床医生。在206例参与者中，130例检出细菌或真菌病原体[63.11%]，其中8例血培养阳性[3.88%]，129例纳米孔靶向测序阳性[62.62%]。纳米孔靶向测序的阳性符合率为87.50%，阴性符合率为38.38%。纳米孔靶向测序诊断血流感染的灵敏度为65.32%，显著高于血培养的6.45%，特异度分别为41.46%和100%。纳米孔靶向测序阳性样本中63.57%为单一病原体，36.43%为多种病原体，而血培养阳性样本中87.50%为单一病原体，仅12.5%为多种病原体。纳米孔靶向测序在血培养阴性患者中额外检出59种细菌和14种真菌。
3.3 抗生素治疗与调整：大多数患者在采血前接受了经验性抗生素治疗。纳米孔靶向测序结果促使14.08%的纳米孔靶向测序阳性患者调整抗生素方案，而血培养结果因阳性率低且周转时间长，在指导及时调整方面的作用有限。临床经验仍是四组患者抗生素调整的主要驱动因素。
3.4 纳米孔靶向测序的临床效应：纳米孔靶向测序结果与最终临床诊断的一致性为55.83%，血培养为43.69%。在所有纳米孔靶向测序或血培养阳性病例中，59例[45.74%]的初始经验性抗菌治疗覆盖了检出病原体，55例[42.64%]的初始经验性抗菌治疗未覆盖或仅部分覆盖纳米孔靶向测序检出的病原体。32例[24.81%]患者因纳米孔靶向测序结果调整用药，其中29例血流感染临床结局改善，3例未得到有效控制。
### 四、讨论与结论
讨论部分指出，纳米孔靶向测序检测技术在血液病相关继发性血流感染诊断中受到广泛关注。纳米孔靶向测序比传统血培养具有更高的病原体检出阳性率和灵敏度，但检出阳性率的提高并不等同于诊断准确性的改善。纳米孔靶向测序检测到更广泛的病原体谱，包括常见和罕见血流感染病原体，其高灵敏度使其容易检测到背景微生物和操作污染物，因此所有阳性发现均需临床鉴别以确保诊断可靠性。纳米孔靶向测序在混合病原体感染检测中具有优势，能识别传统培养方法遗漏的多种共感染病原体，但多重检出病原体的临床意义需临床医生仔细判断。纳米孔靶向测序可补偿经验性抗生素治疗导致传统培养假阴性的局限性，但无法替代血培养获得表型药敏结果。研究局限性包括未涉及病毒感染检测、缺乏健康对照、检测耐药基因指导临床选药的能力不足、单中心回顾性设计以及临床诊断判定过程中可获取纳米孔靶向测序结果可能导致诊断效能被高估。
研究结论为：这项针对疑似血流感染白血病患者的回顾性、单中心诊断性观察研究表明，与传统血培养相比，靶向细菌16S rRNA和真菌ITS区域的纳米孔靶向测序可提高细菌和真菌病原体的检测率，尤其是在接受过经验性抗菌治疗的患者中。然而，该检测方法特异度较低，且存在污染控制不完善和阳性阈值不确定等问题，这些关键局限性使其无法作为独立检测方法获得整体诊断优势。纳米孔靶向测序可作为补充诊断工具提供细菌和真菌病原体的有用辅助信息，但所有测序结果必须在指导治疗决策前，结合临床表现、常规血培养数据、严格的背景污染评估和基于血培养的药敏试验进行综合判定。未来需开展多中心前瞻性研究，以建立白血病血流感染风险患者纳米孔靶向测序检测的统一标准化操作标准和临床解读指南。
