建立盐单胞菌属系统化表征的参考培养方案（Establishing a Reference Cultivation Protocol for Systematic Characterisation of the Halomonas Genus）

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Establishing a reference cultivation protocol for systematic characterisation of the Halomonas genus

　　

引言： 盐单胞菌属（Halomonas）物种因其在高盐、非无菌条件下生长的能力，可降低污染风险并免除资源密集型的灭菌需求，正日益被视为下一代工业生物技术（next-generation industrial biotechnology）的潜力底盘（chassis）。尽管具备上述潜力，多数盐单胞菌物种在初始分离之后仍缺乏系统表征，限制了其推广应用。建立可用于标准实践的盐单胞菌属参考培养条件，是其生物技术与工业应用拓展的前提。 方法： 研究人员测定了代表80个物种的82株盐单胞菌菌株在其各自培养物保藏中心推荐条件下的最大OD600（maximum OD600）和最大比生长速率（maximum specific growth rate），涵盖27组独特的培养参数组合。 结果与讨论： 随后建立的参考培养方案可支持95%菌株在LB（Luria-Bertani）肉汤中生长，条件为低盐（2% NaCl；LB20）或中等盐浓度（8% NaCl；LB80），培养温度为28 °C或37 °C。在其余78株菌株中，仅有2株在采用参考方案培养时，其比生长速率和最大OD600均显著变差。由于菌株提供方推荐温度不同，有23株菌株在28 °C或37 °C下进行了生长测试。转至添加盐的LB肉汤后，10株菌株的比生长速率和11株菌株的最大OD600显著提高。在82株菌株中，67株可在中等盐浓度LB肉汤中生长，而仅有29株可在低盐LB肉汤中生长，表明较高盐度在整个属内具有广泛的容许性。除4株菌株外，内部保藏的所有菌株均可在遵循参考方案时生长。所提出的参考培养条件为：35株菌株适用LB80/28 °C，14株适用LB80/37 °C，13株适用LB80或LB20/28 °C，10株适用LB20/28 °C，5株适用LB80或LB20/37 °C，1株适用LB20/37 °C。该培养框架由补充2%或8% NaCl的LB培养基及28 °C或37 °C培养温度组成，广泛适用于盐单胞菌属，为系统化菌株表征、比较生理学研究以及旨在拓展这一有前景微生物底盘工业应用性的未来工程改造提供了标准化且资源高效的基础。

论文解读

一、研究背景与问题

盐单胞菌属（Halomonas）物种作为非模式细菌底盘，在工业生物技术领域展现出显著潜力。其高盐耐受性使其在长期发酵中具有降低污染风险的优势，并减少灭菌需求，支持开放非无菌发酵工艺。例如，Halomonas campaniensis LS21曾实现连续65天的聚羟基脂肪酸酯（PHA）开放非无菌生产。盐单胞菌为革兰氏阴性、杆状细菌，可在需氧和厌氧环境中生存。Halomonas elongata为属内首个被分离鉴定的物种；截至2023年，属内确认物种近120个，目前原核生物命名名录（LPSN）中已报道130个物种。嗜盐细菌可在低盐（2%–5%）、中盐（5%–20%）和高盐（20%–30%）不同盐浓度下生长，其适应机制包括盐内积聚策略（salt-in）和合成或吸收渗透调节物质（osmolytes）两种主要途径。盐单胞菌可合成两类具有经济价值的产品：依克多因（ectoine）——其主要相容性渗透调节物质，在医药和化妆品领域用于保护蛋白质等大分子；以及聚羟基脂肪酸酯（PHA）——被视为石油基聚合物的可持续替代生物塑料。针对这两类产品的工程改造已取得进展，包括利用CRISPR/Cas9技术提高依克多因产量以及改造Halomonas cupida J9利用玉米秸秆水解液合成PHA。此外，盐单胞菌还被代谢工程改造用于生产甲羟戊酸和番茄红素等非天然产品。

尽管LB（Luria-Bertani）培养基作为丰富且简单的培养基，已被广泛用于细菌快速培养和分子生物学操作，并用于近期分离盐单胞菌菌株的培养及生物过程预研究中的种子培养，但全球认可的菌种保藏机构如DSMZ和ATCC对不同盐单胞菌物种和菌株推荐了多种不同的生长条件。与大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等模式生物不同，盐单胞菌属内众多物种被同时探索和应用于特定生物技术场景，这亟需建立一套可推荐的参考生长条件，以支持多物种的适应性培养、促进结果可比性，并简化盐单胞菌专属方案开发和常规实验室操作。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员从DSMZ和ATCC两个全球可公开获取的菌种保藏中心采购了代表80个物种的82株盐单胞菌菌株（约占属内物种的62%），开展了迄今最广泛的属级培养与适应性评估。研究采用逐步整合策略，将27组不同的保藏中心推荐培养条件系统地过渡到统一的参考条件，每次仅修改一个参数（培养基组成、温度和盐浓度），并在各阶段评估其对生长适应性的影响。主要技术方法包括：基于16S rRNA序列的系统发育树构建（使用MAFFT比对、trimAl修剪、IQ-TREE最大似然推断）；生长动力学测定（在96微孔板中通过CLARIOstar Plus酶标仪进行高吞吐培养，测定比生长速率μ和最大OD₆₀₀）；系统发育信号分析（层次聚类、缠结图分析、Mantel检验、Blomberg's K和Pagel's λ）；以及DASbox?迷你生物反应器中的批次培养验证。

三、研究结果

3.1 82株盐单胞菌菌株在保藏中心推荐条件下的生长表征

82株菌株中76株为模式菌株（type strains），3株为拟议模式菌株，3株非模式菌株。研究人员构建了迄今最全面的78个盐单胞菌物种系统发育树。保藏中心推荐条件显示，多数菌株在2%（31株）或8%（19株）盐浓度下培养，生长温度为28 °C（42株）或37 °C（17株），海洋肉汤2216和DSMZ Medium 514为最常用的培养基。所有菌株在各自推荐条件下的平均比生长速率为0.222 ± 0.116 h^-1，Halomonas halmophila DSM5349最低（μ = 0.030 ± 0.006 h^-1），Halomonas hydrothermalis DSM15725最高（μ = 0.537 ± 0.151 h^-1）。平均最大OD₆₀₀为2.610 ± 1.048，最低为H. gomseomensis DSM18042（0.702 ± 0.274），最高为Halomonas meridiana DSM5425（3.869 ± 0.202）。Halomonas janggokensis DSM18043在推荐培养基中几乎无法生长，后转至LB培养基恢复生长。

3.2 朝向两个盐单胞菌参考生长温度

82株菌株的推荐生长温度范围为22 °C至40 °C，多数集中于28 °C或37 °C。其余23株菌株被评估在任一参考温度下的生长能力。其中12株菌株在两个生长参数上均无显著差异。H. salina DSM5928、H. kenyensis DSM17331和H. halmophila DSM5349的比生长速率分别在28 °C、37 °C和28 °C下显著提高。Halomonas alimentaria DSM15356和Halomonas eurihalina DSM5720在28 °C下比生长速率显著降低，显示对30 °C的偏好。H. elongata DSM2581、Halomonas venusta DSM4743、Halomonas pacifica DSM4742、H. alimentaria DSM15356和H. glaciei DSM15938在28 °C下最大OD₆₀₀显著高于推荐温度。Halomonas sp. DSM7328和Halomonas mongoliensis DSM17332在温度微调后最大OD₆₀₀显著下降。H. alimentaria DSM15356是唯一在两个参数上均显示显著差异的菌株，在28 °C参考温度下比生长速率平均降低41%而最大细胞密度增加51%。

3.3 LB肉汤作为盐单胞菌培养的参考生长环境

约80%的菌株（64/82）能在推荐培养基和LB中均生长。这些菌株在LB中的平均比生长速率（μ = 0.208 ± 0.136 h^-1）与推荐培养基（μ = 0.220 ± 0.103 h^-1）仅差5%；平均最大OD₆₀₀在LB中（2.476 ± 0.986）与推荐培养基中（2.809 ± 0.971）相差12%。13株菌株至少在一个生长参数上获得改善，其中H. mongoliensis DSM17332、H. gomseomensis DSM18042和H. halmophila DSM5349的两个参数均显著提高。仅7株菌株在两个参数上均显著下降。H. janggokensis DSM18043在LB补充10%盐浓度下恢复生长。17株菌株在LB中无法维持生长，主要为推荐培养基盐浓度较低（≤5%）的菌株，其中75%可在后续8%盐浓度条件下恢复生长。H. ilicicola DSM19980偏好10%高渗环境，但在LB80中通过降低渗透压恢复生长。

3.4 评估盐单胞菌低盐培养的可行性

13株在LB配合推荐盐浓度下无法生长的菌株在LB20或LB80中恢复生长。仅4株菌株——H. maura DSM13445、H. muralis DSM14789、H. kribbensis DSM17892和H. tabrizica DSM23018——在LB80或LB20中培养困难，表明海洋肉汤可能含有支持其代谢的必需成分。对48株可在所有条件下生长的菌株进行比较分析，LB20中的平均比生长速率（0.228 ± 0.144 h^-1）与LB80（0.218 ± 0.138 h^-1）相当，但LB80中的最大OD₆₀₀（2.867 ± 0.896）明显高于LB20（2.309 ± 0.858）。15株菌株在LB80中的最大OD₆₀₀显著高于LB20，仅2株相反，表明盐单胞菌偏好高渗环境以积累细胞密度而非加速生长。系统发育信号分析显示，仅在低盐条件（LB20）下最大OD₆₀₀表现出显著的系统发育信号（Pagel's λ = 0.757, p < 0.001），提示低盐胁迫下细胞密度可能存在系统发育约束。两对同种不同菌株（H. caseinilytica DSM18067/DSM23509和H. lutea DSM19221/DSM23508）在定量生长表现上存在显著差异，表明系统发育邻近性更适合预测定性表型行为而非定量表现。

3.5 朝向基于LB的参考培养条件

通过上述逐步评估，27组不同的保藏中心推荐条件被系统整合为四种参考条件之一：LB补充2%（LB20）或8%（LB80）NaCl，在28 °C或37 °C下培养，适用于本研究中78株盐单胞菌菌株。H. kenyensis DSM17331、H. johnsoniae DSM21197和H. lactosivorans DSM103220在整个过渡过程中表现出卓越的稳健性。除4株无法在LB中生长的菌株外，60株菌株被分配了唯一的参考条件，其余18株可在任一盐浓度下生长，仅需推荐温度。具体分配为：35株适用LB80/28 °C，14株适用LB80/37 °C，13株适用LB80或LB20/28 °C，10株适用LB20/28 °C，5株适用LB80或LB20/37 °C，1株适用LB20/37 °C。层次聚类显示参考条件下菌株表型趋同性增强。生物反应器放大验证中，H. magadiensis DSM15367、H. stevensii DSM21198和H. elongata DSM2581在LB80中的OD_max均超过LB20，与微孔板结果趋势一致，其中H. stevensii DSM21198达到最高OD₆₀₀（6.507 ± 0.170）。

四、讨论总结与研究结论

本研究建立了覆盖盐单胞菌属82株菌株（代表80个物种）的参考培养框架，将27组不同的保藏中心推荐条件整合为四种标准化参考条件，支持95%受试菌株的生长。研究提出的两步决策规则为：默认使用LB80，在28 °C或37 °C中选择更接近菌株原始分离温度者；若默认条件下无生长，则以LB20作为备选。该规则回溯应用于82株菌株时，LB80默认条件单独覆盖67/82株（82%），LB20备选方案额外解决11株，累计成功率达78/82株（95%）。该框架采用经济有效的培养基和适度盐浓度，在保持盐单胞菌属标志性耐盐特性的同时最小化对设备和基础设施的腐蚀负担。研究结论指出，该参考培养框架并非旨在最大化单株菌株在严格控制生物过程条件下的性能，而是为初步菌株表征和合成生物学工作流程提供标准化的切入点，为系统化菌株表征、比较生理学研究和未来工程改造奠定基础，同时为其他研究不足且分类多样的微生物属的标准化提供了可迁移的模型。