基于PEG介导的原生质体转化系统实现穿孔病病原菌Wilsonomyces carpophilus的EGFP标记

《Frontiers in Microbiology》：A PEG-mediated protoplast transformation system for EGFP labeling of the shot-hole pathogen Wilsonomyces carpophilus

　　

Wilsonomyces carpophilus是一种引起核果类果树穿孔病的真菌病原体，包括天山野果林中的野生杏树种群。由于缺乏有效的遗传转化系统，该病原体的分子研究受到限制。在本研究中，研究人员建立了一种针对W. carpophilus菌株G052 5 m2的PEG介导的原生质体转化系统。评估了影响原生质体制备的关键因素，包括菌丝培养时间、酶组合、消化时间和渗透压稳定剂。最优条件为：24小时龄菌丝，使用20 g/L Driselase和25 g/L Snailase酶解5小时，并以1.2 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂，可获得高达4.13 × 106个原生质体/mL。在优化条件下，PEG介导的转化效率计算为每微克质粒DNA获得1.75个转化子。PCR检测和EGFP荧光观察均成功验证了外源基因在真菌转化子中的表达。转化子与野生型菌株在菌落形态、营养生长和致病性方面未观察到明显差异。本研究首次建立了W. carpophilus的PEG介导原生质体转化系统，为未来研究这种重要核果类病原体的基因功能、致病机制及寄主-病原互作提供了实用的分子工具。

一、研究背景、现存问题与研究意义

天山野果林是温带果树多样性的重要自然基因库，其中野生杏（Prunus armeniaca）作为优势孑遗物种，保存着栽培杏的祖先遗传信息，具有重要的科学和保护价值。然而，由子囊菌门真菌Wilsonomyces carpophilus引起的穿孔病严重威胁着这些野生杏种群的存续。该病原体在全球广泛分布，侵染杏、桃等重要经济核果类寄主，导致叶片穿孔、果实褐斑和枝条枯死，严重时可造成30%至90%的产量损失。在天山野果林中，该病害发病率高达92.94%，病情指数达48.35，对野生杏种群构成严重威胁。

当前对该病害的管理主要依赖化学防治，但由于天山野果林生态敏感，长期大规模施用农药可能增加抗药性风险并破坏土壤微生物群落，不利于生态保护目标。因此，亟需从分子水平深入理解该病原体的生物学特性、毒力机制及其与寄主的互作关系。然而，W. carpophilus的分子研究严重受限，根本原因在于缺乏成熟稳定的遗传转化系统。虽然已有农杆菌介导转化（ATMT）系统的报道，但尚未建立PEG介导的原生质体转化方案。相较于ATMT，PEG介导的原生质体转化所需实验时间更短，无需专用双元载体，可作为互补工具用于基因功能分析。为此，本研究旨在建立并优化W. carpophilus的PEG介导原生质体转化系统，为其分子研究提供技术基础。

二、主要关键技术方法

研究人员采用PEG介导的原生质体转化法。首先通过酶解去除真菌细胞壁制备原生质体，随后利用聚乙二醇（PEG）和氯化钙辅助外源DNA进入原生质体，最终筛选稳定转化子。研究中使用了携带增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）作为报告基因和潮霉素B磷酸转移酶基因（hyg）作为选择标记的重组质粒PCT74-EGFP进行转化验证。所用菌株W. carpophilus G052 5 m²分离自新疆伊犁霍城县采集的患病野生杏果实。

三、研究结果

3.1 Wilsonomyces carpophilus菌株G052 5 m²对潮霉素B的敏感性

为建立可靠的转化子筛选体系，研究人员测试了不同浓度潮霉素B对野生型菌株的抑制效果。结果表明，10 μg/mL的潮霉素B即可有效抑制该菌株的生长，因此在后续转化实验中，初筛阶段使用25 mg/L潮霉素B以减少假阳性克隆。

3.2 酶组合对原生质体释放的影响

在1.2 mol/L KCl渗透压稳定条件下，比较了四种酶处理的效果。单独使用蜗牛酶（Snailase）产率最低；蜗牛酶加溶壁酶（Lysing Enzymes）的组合有所提高；而20 g/L Driselase加25 g/L蜗牛酶的双酶组合获得了最高的原生质体产量，达到1.08 × 10⁶个/mL。再加入溶壁酶反而使产量下降，表明双酶组合最为有效。

3.3 菌丝培养时间和消化时间对原生质体产量的影响

测试了8、16、24和42小时菌龄的菌丝。8小时菌龄产量最低，24小时菌龄表现最佳，酶解5小时后产量达1.67 × 10⁶个/mL，延长至7小时可达2.32 × 10⁶个/mL。42小时菌龄产量下降至1.30 × 10⁶个/mL。综合考虑产量和实验效率，选用24小时菌龄和5小时酶解时间。

3.4 渗透压稳定剂对原生质体产量的影响

测试了四种渗透压稳定剂：0.7 mol/L KCl、1.2 mol/L KCl、0.7 mol/L NaCl和1.2 mol/L NaCl。1.2 mol/L NaCl获得最高产量，达4.13 × 10⁶个/mL，显著高于相同条件下的1.2 mol/L KCl（1.95 × 10⁶个/mL）。因此选定1.2 mol/L NaCl为最优渗透压稳定剂。

3.5 原生质体释放的显微观察及形态特征

显微镜观察显示，原生质体主要从菌丝顶端释放，也有侧向释放。获得的原生质体直径范围为5.02至14.58 μm，平均直径为8.57 μm。

3.6 PEG介导转化及转化子验证

在优化条件下，使用PCT74-EGFP质粒进行转化。经三次连续潮霉素B筛选后获得9个稳定抗性克隆，其中7个经PCR扩增出预期的236 bp片段，阳性率为77.78%。随机选取两个PCR阳性转化子进行荧光显微镜观察，均检测到绿色荧光信号，证实egfp基因成功表达。转化效率为每微克质粒DNA获得1.75个转化子。

3.7 野生型与转化子的表型差异分析

对已验证的阳性转化子进行表型分析发现，野生型与转化子在菌落形态、平均菌落面积和菌丝生长速率方面均无显著差异（p > 0.05），表明遗传转化未影响菌株的营养生长。

3.8 EGFP表达转化子的有丝分裂稳定性

经过五轮非选择性培养基继代培养后，7个转化子中有6个仍能在含潮霉素B的选择性培养基上生长。其中4个保持正常EGFP荧光，2个荧光信号明显减弱，1个丧失荧光。这表明部分转化子存在荧光衰减现象。

3.9 荧光菌株的致病性验证

将荧光转化子和野生型菌株分别接种于野生杏叶片。两种接种组在2天时均出现可见坏死斑，此后病斑逐渐扩大。所有时间点的病斑直径、最终病斑面积和病斑扩展速率均无统计学显著差异（p > 0.05），证明egfp表达不影响W. carpophilus的致病性。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，建立W. carpophilus遗传转化系统对于研究其基因功能、致病机制及寄主-病原互作具有重要意义。研究发现，Driselase和蜗牛酶的双酶组合效果优于单酶或三酶组合，说明更高复杂度的酶混合物并不总能带来更好的原生质体产量，酶与物种特异性细胞壁组成的匹配更为关键。24小时菌龄代表了生理上的最佳状态，既积累了足够的生物量，又避免了细胞壁过度交联增厚。在渗透压稳定剂方面，Na⁺比K⁺更能维持膜完整性，表明离子种类也影响原生质体制备效果。W. carpophilus对潮霉素B的高度敏感性（10 μg/mL即可完全抑制）远低于许多其他植物病原真菌，凸显了经验性确定筛选压力的必要性。部分潮霉素B抗性克隆为假阳性，可能源于异核体形成或质粒部分整合，因此多轮抗生素纯化结合分子验证至关重要。与已有的ATMT系统相比，PEG介导的原生质体转化以菌丝为起始材料，对于产孢缓慢的菌株可大幅缩短样品准备时间，两者互为补充。

研究结论：本研究首次建立了W. carpophilus菌株G052 5 m²的PEG介导原生质体转化系统。优化方案使用24小时菌龄菌丝，以20 g/L Driselase和25 g/L蜗牛酶酶解5小时，1.2 mol/L NaCl为渗透压稳定剂，原生质体产量可达4.13 × 10⁶个/mL。通过PCT74-EGFP质粒的成功导入，经抗生素筛选、PCR扩增和EGFP荧光观察得到验证。转化子与野生型在菌落形态和生长速率上无显著差异，证实了该转化系统的可行性。该系统为未来研究这一重要核果类病原体的基因功能、致病机制及寄主-病原互作提供了实用的分子工具。