整合野生鸟类与环境样本可强化禽流感监测

《Journal of Applied Ecology》：Integrating wild bird and environmental samples can strengthen avian influenza surveillance

　　

摘要
禽流感病毒在野生鸟类中传播的早期检测对于预测家禽感染压力和区域性病毒扩散至关重要。当前欧洲立法主要针对死亡、患病或被猎捕的野生鸟类，而环境采样尚未正式纳入监测计划。本研究比较了基于野生鸟类和环境采样策略在禽流感监测中的敏感性，并评估了环境采样的附加价值。

在2024–2025年意大利东北部高致病性禽流感流行季期间，研究人员在高风险湿地采集了野生鸟类及其环境样本。被捕获和被猎捕的野生鸟类接受了口咽拭子、泄殖腔拭子、羽毛拭子及脑组织的检测；环境样本包括新鲜粪便和通过被动采样器（passive samplers, PS）采集的地表水。研究采用贝叶斯潜类别模型（Bayesian latent class models, BLCM）估计了各样本类型（鸟类个体层面）和监测策略（现场访问层面）的敏感性以及病毒流行率。

在鸟类个体层面，H5高致病性禽流感（high pathogenicity avian influenza, HPAI）检测的估计敏感性以脑组织样本最高（0.82，95%可信区间[credible interval, CrI]=0.58–0.99），其次为口咽拭子（0.63，95% CrI=0.25–0.98），而泄殖腔拭子（0.05，95% CrI=0.00–0.22）和羽毛拭子（0.09，95% CrI=0.00–0.32）的敏感性明显较低。

在现场访问层面，基于环境采样的策略在M基因检测中具有最高的估计敏感性：地表水为0.77（95% CrI=0.63–0.89），粪便样本为0.71（95% CrI=0.57–0.84）。被猎捕和捕获野生鸟类的估计流行率分别为M基因5.2%（95% CrI=2.4%–8.6%）、H5亚型3.1%（95% CrI=1.3%–6.3%）以及H5高致病性禽流感2.7%（95% CrI=1.1%–6.0%）。

综合与应用。环境采样策略显示出高于鸟类样本的敏感性，尽管其检测主要依赖M基因，但可通过增加在高风险湿地检测禽流感病毒循环的机会来补充野生鸟类采样，且无需依赖接触到感染鸟类。将快速环境筛查与针对性的鸟类后续采样相结合，可强化早期预警系统，改善监测的空间靶向性，并支持采取更及时的措施以降低病毒传入家禽种群的风险。

论文解读文章

高致病性禽流感（high pathogenicity avian influenza, HPAI），尤其是由H5N1病毒引起的疫情，已在全球范围内对家禽造成反复和广泛的暴发，导致严重的社会经济后果以及对食品系统和贸易的重大干扰。与此同时，野生及家养哺乳动物中溢出事件的数量不断增加，并伴有散发性人间病例，凸显了这些病毒不断扩大宿主范围及相关公共卫生风险。野生鸟类通常代表HPAI传入此前未受影响地区的最早且最可能的来源，因此，对野生鸟类及其环境进行有效监测对于HPAI病毒的早期检测至关重要，可及时实施降低向家禽传播风险的风险缓解措施。当前欧洲立法规定，早期检测工作应优先对死亡、受伤或患病的野生鸟类以及具有临床症状的被猎捕鸟类进行采样和检测，并采用基于风险的监测设计，考虑鸟类学、病毒学、流行病学与环境因素。然而，现行欧盟监测条款采用基于输出的框架，未规定野生鸟类监测的具体样本类型，不同样本类型对于检测野生鸟类HPAI循环的相对敏感性仍存在不确定性。近年来，环境采样作为禽流感监测的补充手段日益受到关注，包括采集和检测水与新鲜粪便样本，这些方法兼具非侵入性和易部署性，并可在群体水平上实现病原体检测。尽管环境监测在提供生态系统内病毒循环信息方面具有潜力，但由于对检测结果的流行病学解读及其在既有监测和病例定义系统中的作用存在不确定性，其尚未被纳入现行监管框架。因此，本研究旨在比较基于野生鸟类和环境采样策略在禽流感/H5 HPAI监测中的应用价值，通过检测被猎捕和捕获的野生鸟类（口咽拭子、泄殖腔拭子、羽毛拭子和脑样本）以及环境（粪便、地表水）中的不同样本类型，应用贝叶斯潜类别模型（Bayesian latent class models, BLCM）估计禽流感病毒流行率并比较环境来源与动物来源样本的敏感性，为增强禽流感监测的新型综合策略提供见解。

研究人员在2024–2025年于意大利东北部（威尼托和弗留利-威尼斯朱利亚大区）开展了监测活动，包括活捕野生鸟类、被猎捕野生鸟类和环境样本三个互补组成部分。所有采样点均位于禽流感引入和维持高风险区域，包括湿地和野生鸟类主要越冬及迁徙区域。活捕鸟类于2024年9月至2025年3月每周采样，使用游泳式捕捉器在三个沿海湿地站点进行捕获，每只鸟采集口咽拭子、泄殖腔拭子和羽毛拭子。被猎捕鸟类于2024年9月至2025年1月在60次狩猎活动中采集，收集口咽拭子、泄殖腔拭子、羽毛拭子以及脑拭子或组织（以下简称脑样本）。环境样本于2024年10月至2025年3月每周在四个湿地采集，使用被动采样器（passive samplers, PS）采集地表水，每个采样器内置六张17 cm2的尼龙膜，部署时间为7天；同日，在PS安装池塘附近机会性采集新鲜粪便样本。实验室分析方面，动物来源样本经标准处理后，使用MagMAX Pathogen RNA/DNA Kit在KingFisher Flex仪器上提取核酸；粪便样本以1:4（w/v）稀释后与NucliSENS easyMAG裂解缓冲液混合，PS的六张膜按三张一组分成两池分别处理，采用自动化提取方案。动物和环境样本均以靶向M基因的qRT-PCR进行禽流感病毒筛查，鸟类来源样本以定量循环（quantification cycle, Cq）值≤36判定为M基因阳性，环境样本任何靶特异性扩增均视为阳性。所有M基因扩增阳性样本（包括Cq>36的可疑鸟类样本）均进行H5亚型鉴定，并通过Sanger测序确定致病型。在统计分析中，研究人员应用BLCM联合估计活鸟和环境样本的敏感性（sensitivity, Se）与特异性（specificity, Sp）以及湿地中禽流感病毒流行率，分别采用鸟类个体层面（流行病学单位=个体鸟）和现场访问层面（流行病学单位=某湿地的一次现场采样访问）的数据。在鸟类个体层面，模型联合估计感染流行率（prevalence, Prev）及各样本类型（口咽拭子、泄殖腔拭子、羽毛拭子和脑样本）的Se；在现场访问层面，模型估计污染现场访问比例（proportion of contaminated field visits, PCFV）及各监测策略（捕获鸟类、被猎捕鸟类、羽毛拭子、地表水和粪便）的Se。所有模型均在R环境中使用cmdstanr包实现，采用两类条件独立潜类别模型，假设所有样本类型和监测策略均不完美，Sp先验采用Beta(30,1)分布，流行率和Se先验采用Beta(1,1)分布。

研究结果方面，**3.1 不同样本类型和监测策略中M基因、H5和H5 HPAI的检出**：研究共采集4850份样本，来自588只捕获和2118只被猎捕野生鸟类，包括2585份口咽拭子、897份泄殖腔拭子、736份羽毛拭子和632份脑样本。总体而言，3.22%（156/4850）的样本M基因阳性，2.10%（102/4849）为H5阳性，1.84%（89/4849）为H5 HPAI阳性。脑样本检出率最高，M基因阳性率为9.49%（60/632），H5为6.80%（43/632），H5 HPAI为6.33%（40/632）；口咽拭子阳性率较低，M基因阳性率2.63%（68/2585），H5为1.97%（51/2585），H5 HPAI为1.86%（48/2585）；泄殖腔拭子检出率同样较低，M基因阳性率2.12%（19/897），H5为0.45%（4/897），且无H5 HPAI阳性样本；羽毛拭子检出率最低，M基因阳性率1.22%（9/736），H5为0.54%（4/735），H5 HPAI为0.14%（1/735）。环境样本方面，共采集186份地表水样本和551份粪便样本，M基因阳性率分别为38.17%（71/186）和19.06%（105/551）；H5在地表水中检出率为4.30%（8/186），粪便中为0.73%（4/551）；H5 HPAI在地表水中阳性率为1.08%（2/186），粪便中为0.18%（1/551）。不同监测策略和区域的现场访问检出率存在差异，环境监测策略（地表水和粪便）在各区域的M基因现场访问检出率均高于野生鸟类策略。**3.2 野生鸟类禽流感病毒流行率估计及各样本类型敏感性**：基于BLCM分析，被猎捕和捕获鸟类的M基因Prev估计为5.2%（95% CrI: 2.4–8.6%），H5为3.1%（95% CrI: 1.3–6.3%），H5 HPAI为2.7%（95% CrI: 1.1–6.0%）。敏感性估计方面，脑样本的Se最高（M基因0.87至H5 HPAI 0.82），其次为口咽拭子（M基因0.47至H5 HPAI 0.63），而泄殖腔拭子和羽毛拭子的Se明显较低。**3.3 不同监测策略的敏感性估计及污染现场访问比例**：由于环境样本中H5和H5 HPAI阳性数量有限，该分析仅针对M基因进行。PCFV估计为0.85（95% CrI: 0.72–0.97），表明所选高风险区域和期间约85%的现场访问被估计为受禽流感病毒污染。环境样本的Se最高，地表水为0.77（95% CrI: 0.63–0.89），粪便为0.71（95% CrI: 0.57–0.84）；野生鸟类样本中，捕获鸟类Se为0.53（95% CrI: 0.31–0.76），被猎捕鸟类（0.24，95% CrI: 0.14–0.35）和羽毛拭子（0.21，95% CrI: 0.07–0.39）Se最低。

讨论部分指出，估计的M基因流行率与意大利越冬水禽中先前报告的低病毒学流行率一致。环境采样策略在现场访问水平上表现出最高的检测敏感性，其中PS能够以相对较低的采样工作量高效检出M基因，这反映了地表水采样可捕获使用同一湿地的多只鸟类造成的病毒污染这一内在特性。粪便样本也频繁检出禽流感病毒，但H5或HPAI检出较少，这可能反映许多HPAI毒株的粪便排毒有限。在鸟类来源样本中，脑样本表现最佳，平均Se>0.82，反映了HPAI病毒的嗜神经性；口咽拭子M基因平均Se>0.47，靶向H5 HPAI时增至0.63，符合HPAI病毒在水禽呼吸道的复制特性。泄殖腔拭子和羽毛拭子的Se较低。环境采样中，PS有策略性部署需求，且地表水中病毒物质更易发生基因组降解，加之病毒的分散性，常导致阳性样本亚型/致病型鉴定成功率有限，这是该策略的主要局限。然而，基于PS的监测可提供环境污染物时空分布的流行病学相关信息，间接反映野生鸟类储存宿主群体中禽流感病毒的循环情况。当前欧盟立法主要依赖尸体发现、被猎捕鸟类和目标捕获进行野生鸟类监测，环境采样未被正式纳入，这一监管空白可能降低在高风险湿地生态系统中检出早期病毒循环的概率。研究结果支持将被动地表水采样器和粪便采样整合到现有框架中，因为这些汇集性、群体水平的样本可以从当地鸟类种群的更大部分捕获病毒排毒，包括未被狩猎或捕获活动拦截的个体。同时，研究也承认若干局限性，包括环境采样设计基于可行性而非概率选择、数据来源于异质性监测方案并在地点和日期间不均衡、残留的时空依赖性可能影响估计精度等。研究结论指出，环境采样，尤其是使用被动地表水采样器和粪便样本，代表了传统野生鸟类监测的一种高度敏感且实用的补充手段，可用于基于M基因筛查的禽流感病毒检测。尽管环境样本的M基因检测不能直接提供亚型或致病性信息，但可作为病毒存在的早期指标，指导使用个体鸟类采样的靶向后续调查。将这些方法整合到现有监测框架中，可在保持必要时获取亚型特异性信息能力的同时，增强早期预警能力。总体而言，这些发现支持对当前禽流感监测策略的针对性细化，超越现行监管要求，使监测设计与禽流感生态学及检测方面的最新科学证据保持一致。