紫球藻（*Porphyridium purpureum*）氯仿提取物脂肪酸谱特征及其与环丙沙星联用对肠道病原菌的协同抗菌活性研究

《Frontiers in Natural Products》：Fatty acid profile and antimicrobial activity of chloroform extracts from the red microalga Porphyridium purpureum against pathogenic intestinal bacteria

　　

**摘要**

**引言**：诸如紫球藻（*Porphyridium purpureum*）之类的微藻，因其独特的生化组成和潜在生物活性而受到研究关注。抗菌素耐药性是一个重大公共卫生问题，尤其影响肠道菌群中的肠道细菌。

**方法**：研究人员通过测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）评估了对致病性肠道细菌（包括大肠埃希菌[*Escherichia coli*]、粪肠球菌[*Enterococcus faecalis*]和鼠伤寒沙门菌[*Salmonella typhimurium*]）的抗菌活性。采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography–mass spectrometry，GC–MS）技术分析脂肪酸谱。研究人员在Vero细胞中评估了*P. purpureum*脂质提取物的细胞毒性，并计算了选择性指数（selectivity index，SI），即细胞毒性与抗菌活性之比。

**结果**：分离的脂质提取物和*P. purpureum*胞外多糖均未显示直接抗菌活性，然而，脂质提取物与环丙沙星联用时，对*S. typhimurium*和*E. coli*表现出协同效应。脂肪酸分析显示主要化合物包括棕榈酸甲酯、花生四烯酸甲酯和亚油酸甲酯。该提取物在Vero细胞中的半数抑制浓度（IC₅₀）为1149.21 μg/mL，选择性指数>10，表明细胞毒性较低。

**讨论**：观察到的协同活性仅限于与环孢沙星联用并对抗革兰阴性菌的评估组合。提取物中鉴定出的脂肪酸（如棕榈酸甲酯、花生四烯酸甲酯和亚油酸甲酯）可能通过靶向膜完整性而有助于这种差异性活性。

**结论**：*P. purpureum*脂质提取物单独测试时未表现出抗菌活性，但与环丙沙星联用时，对革兰阴性菌显示出潜在的调节作用。这些发现表明，该提取物可作为具有抗生素佐剂潜力的化合物来源，并有必要进一步研究以鉴定活性成分并阐明所观察到的协同效应的机制。

**紫球藻（*Porphyridium purpureum*）氯仿提取物研究解读**

**一、研究背景与目的**

肠道菌群是一个由数千种共生与致病细菌构成的复杂生态系统，对宿主稳态、肠道屏障完整性、免疫、代谢及抗病原体防御具有重要维持作用。抗菌药物滥用、不良饮食习惯、吸烟及致病菌定植等因素可破坏肠道微生态平衡，诱发菌群失调，进而扩大耐药基因储库，加剧抗菌素耐药性（antimicrobial resistance，AMR）的传播。AMR已成为21世纪最严峻的全球公共卫生挑战之一：据全球细菌抗菌素耐药性负担报告，2019年耐药病原菌直接导致约127万人死亡，相关死亡总数约495万人；预测至2050年，若不采取有效措施，细菌耐药相关年死亡人数恐达1000万。与此同时，新型抗生素的研发速度持续放缓，现有在研化合物多对革兰阴性菌活性受限，且缺乏全新作用机制。在此背景下，天然产物作为新抗菌药物的生物勘探来源备受关注。水生微藻因暴露于盐度、光照、营养可利用性等复杂环境条件，能够刺激具有生物活性的初级代谢产物合成，其中脂类尤其是长链脂肪酸备受瞩目。红微藻紫球藻（*Porphyridium purpureum*）以其代谢多样性著称，可产生硫酸化胞外多糖、藻胆蛋白及多种脂肪酸，其抗病毒、抗氧化、抗炎活性已被报道。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）如花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）可通过作用于细菌胞质膜、改变通透性和结构完整性，发挥抗菌效应。因此，表征*P. purpureum*脂质提取物的脂肪酸谱，对理解其代谢产物在肠道病原菌抗菌活性中的角色具有重要意义。本研究旨在表征*P. purpureum*氯仿提取物的脂质谱，提取其胞外多糖，评估两种组分对肠道致病菌的抗菌活性，并探究其作为生物活性化合物来源用于开发控制细菌感染的替代策略的潜力。

**二、主要技术方法**

研究人员与AlgaSul?微藻生物技术公司合作，在15 L气升式光生物反应器中，于25 °C、150 μmol光子 m^-2 cm^-1人工光照、12 h光/12 h暗光周期条件下，以添加F/2培养基的人工海水批量培养*P. purpureum*约9天，收获对数期后期生物量。采用氯仿为溶剂、1:6（生物量g/溶剂mL）比例、三次循环磁力搅拌的渗漉萃取法提取总脂质；脂质经三氟化硼衍生化后，利用气相色谱-质谱联用（GC–MS）测定脂肪酸甲酯（fatty acid methyl esters，FAMEs）谱。胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）采用冷乙醇沉淀结合超声辅助法提取，并用傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared spectroscopy，FTIR）表征官能团。抗菌活性依据CLSI M100指南，用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）；提取物与抗生素的相互作用采用棋盘微量稀释法计算分数抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）评估；以Vero细胞系进行细胞毒性试验，用刃天青染色法计算半数抑制浓度（IC₅₀），并据此计算选择性指数。受试菌株来自里奥格兰德联邦大学新药开发核心菌库，为标准参考株大肠埃希菌（ATCC 25922）、鼠伤寒沙门菌肠道亚种（ATCC 14028）和粪肠球菌（ATCC 51299）。

**三、研究结果**

**1. 脂质提取率与脂肪酸表征**

收获的*P. purpureum*生物量经渗漉萃取法获得总脂质得率为16%（w/w，相对于干重）。GC–MS共鉴定出7种FAMEs，代表衍生化前脂质提取物中存在的脂肪酸。主要组分为棕榈酸甲酯（42.05%）、花生四烯酸甲酯（22.73%）和亚油酸甲酯（17.91%），其余依次为二十碳五烯酸甲酯（8.64%）、油酸甲酯（4.35%）、α-亚麻酸甲酯（2.30%）和硬脂酸甲酯（2.02%）。

**2. 胞外多糖的FTIR表征与提取率**

EPS提取率为841.7 mg/L培养物。FTIR光谱中，3340 cm^-1处吸收带归属于O–H伸缩振动，1664 cm^-1处吸收带与羧基振动相关，指示存在酸性官能团及相关有机化合物，另有670 cm^-1（烯烃C–H）、1644 cm^-1（C=O或C=C）、1108 cm^-1（CH₂/CH₃变形，可能含C–O或S=O）等吸收特征，与*Porphyridium*属文献吻合。

**3. 单独抗菌活性**

在800至6.25 μg/mL浓度范围内，氯仿提取物和EPS对鼠伤寒沙门菌肠道亚种、大肠埃希菌和粪肠球菌均未表现出生长抑制作用。

**4. 与抗生素联用的协同效应**

棋盘法结果显示，提取物与环丙沙星联用时，6.25 μg/mL提取物将环丙沙星对鼠伤寒沙门菌肠道亚种的MIC从4 μg/mL降至1 μg/mL（FICI = 0.26），12.5 μg/mL提取物将环丙沙星对大肠埃希菌的MIC从4 μg/mL降至2 μg/mL（FICI = 0.50），均判定为协同作用。而提取物与氨苄西林联用对粪肠球菌未显示协同作用，FICI为2，判定为无关作用。尽管MIC降低，依据CLSI标准（2021）细菌敏感性类别并未改变：鼠伤寒沙门菌肠道亚种仍为耐药，大肠埃希菌仍为中介。

**5. 细胞毒性与选择性指数**

在Vero细胞中，氯仿提取物的IC₅₀为1149.21 μg/mL（0.1005 ± 0.0298）。针对鼠伤寒沙门菌肠道亚种和大肠埃希菌的选择性指数（selectivity index, SI）分别为183.8和91.9，均远高于10的安全阈值。

**四、讨论总结**

脂肪酸谱分析结果与此前针对*P. purpureum*的化学表征一致，尤其以棕榈酸（PA, C16:0）和花生四烯酸（ARA, C20:4n-6）等初级代谢物为主。ARA因多双键结构可增强膜流动性，为细胞和类囊体膜的重要结构组分；饱和脂肪酸则在叶绿体内合成，兼具能量储备和前体功能。与Lu等（2020）研究相比，本研究采用的碱性pH和盐水培养条件有利于长链脂肪酸转化酶活性，与较高的脂质积累相符。ARA作为*P. purpureum*的特征性积累产物，源于该红藻以omega-6合成途径为主导的特点。

尽管单独无抗菌活性，氯仿提取物与环丙沙星联用对革兰阴性菌表现出协同效应，提示其可能作为抗生素佐剂而非直接抗菌剂发挥作用。已有研究显示PUFA可破坏细菌质膜，促进药物渗入胞内，且效果与其不饱和度及分子大小相关——例如花生四烯酸与庆大霉素联用可将后者对金黄色葡萄球菌的MIC从37 ± 22 μg/mL降至1.7 ± 0.5 μg/mL。在革兰阴性菌中，中链脂肪酸（如癸酸、香叶酸）与左氧氟沙星联用对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的FICI分别达0.022、0.125和0.260。本研究首次报道*P. purpureum*氯仿提取物可增强环丙沙星对大肠埃希菌和鼠伤寒沙门菌肠道亚种的作用，但未对粪肠球菌与氨苄西林联用产生协同，此差异需谨慎解读——因革兰阴性菌与粪肠球菌使用了不同抗生素（环丙沙星对氨苄西林），不能简单归因于细胞壁结构差异。协同作用可能源于提取物中多种脂肪酸（如棕榈酸、亚油酸等）对膜性质的联合改变，而非单一成分所致。在细胞毒性方面，提取物对细菌的作用强于对哺乳动物细胞（Vero细胞）的作用，可能与真核细胞膜含胆固醇、而原核细胞膜结构（肽聚糖层、外膜脂多糖和孔蛋白）及较低代谢复杂度相关，这种差异促进了选择性。

**五、结论**

本研究中，经GC–MS分析，*P. purpureum*氯仿提取物的FAMEs谱以棕榈酸甲酯、花生四烯酸甲酯和亚油酸甲酯为主要成分，表明棕榈酸、花生四烯酸和亚油酸是脂质提取物的主要脂肪酸。然而，提取物单独在所测浓度下未表现出抗菌活性。与环丙沙星联用时，提取物降低了该抗生素对革兰阴性菌鼠伤寒沙门菌肠道亚种和大肠埃希菌的MIC，提示其对环丙沙星活性具有潜在的调节作用。相反，对革兰阳性菌粪肠球菌未观察到协同效应，表明该调节活性可能取决于特定的细菌-抗生素组合；且由于革兰阴性菌与粪肠球菌所用抗生素不同，需开展进一步研究方能将差异归因于细菌细胞包膜特征。提取物在Vero细胞中IC₅₀为1149.21 μg/mL，所得选择性指数进一步支持其作为佐剂类化合物的潜力。综上，*P. purpureum*提取物虽不宜作为独立抗菌剂使用，但可作为环丙沙星活性的调节剂，尤其在对抗革兰阴性菌方面。未来研究应聚焦于分离并逐一评价已鉴定的脂肪酸，以阐明产生协同效应的具体化合物，并拓展其在新型抗菌药物发现中的应用前景。