《Pest Management Science》：Oral RNAi reduces survival and grain loss in Rhyzopertha dominica, including phosphine-resistant populations
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**背景**
磷化氢熏蒸仍是储粮保护的核心手段，然而谷蠹（*Rhyzopertha dominica*）中广泛存在的磷化氢抗性正威胁其长期有效性。通过摄入双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）实现的RNA干扰（RNA inter
**背景**
磷化氢熏蒸仍是储粮保护的核心手段，然而谷蠹（*Rhyzopertha dominica*）中广泛存在的磷化氢抗性正威胁其长期有效性。通过摄入双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）实现的RNA干扰（RNA interference，RNAi）提供了一种与传统杀虫剂截然不同的序列特异性作用模式（mode-of-action，MoA）。然而，实际应用开发仍需鉴定口服有效的靶标基因、证明储粮保护效益，并在磷化氢抗性种群中验证其有效性。
**结果**
口服递送dsRNA可产生剂量依赖性的成虫存活率降低，在300 ng μL?1浓度下连续暴露10天后，五个靶基因处理组的存活率介于3%至12%之间，而对照组存活率高于90%。dsRNA暴露后，靶标转录本水平降至对照组的15%–48%，证实了RNAi活性。dsRNA处理还显著减少了粮粒损害，在300 ng μL?1浓度下，相对粮粒重量损失可低至水处理对照组的8%。口服RNAi在不同磷化氢抗性水平的种群中均保持有效性，在高度抗性种群（抗性倍数RR = 1173.63）中，第10天校正死亡率达到约82%。
**结论**
在测试条件下，口服RNAi能够抑制谷蠹种群并减少粮粒损害，同时在磷化氢抗性种群中保持有效性。这些发现支持RNAi作为一种补充性作用模式，有助于丰富储粮保护与抗性管理的治理选项。? 2026 The Author(s). *Pest Management Science* published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of Society of Chemical Industry.
## 论文解读
### 一、研究背景与科学问题
储粮谷物在储存、运输和销售过程中持续遭受害虫威胁，造成数量和品质的双重损失。谷蠹（*Rhyzopertha dominica*）是全球主要产粮区最具破坏性的储粮害虫之一，其成虫和幼虫均在粮粒内部取食，可直接导致重量损失、种子活力下降、品质劣变，并增加对次生害虫和微生物污染的易感性。由于侵染常在外部症状显现之前已在粮堆内部发展，有效治理高度依赖可规模化应用的预防性处理和补救性工具。
磷化氢（PH?）熏蒸凭借其良好的穿透性、较低的成本和广谱杀虫活性，始终是储粮保护中最重要的补救性处理手段。然而，磷化氢抗性已在包括谷蠹在内的储粮害虫中广泛蔓延，部分种群的抗性水平已达到极高水平，并在实际作业条件下与熏蒸失败密切相关。磷化氢抗性涉及rph1和rph2两大主要抗性位点，并与呼吸作用、能量代谢和氧化应激反应的改变密切相关。与此同时，由于登记的熏蒸剂和触杀性杀虫剂种类有限，储粮系统内的抗性管理面临严峻挑战。因此，亟需开发具有不同作用模式（mode-of-action，MoA）的新型工具，以补充磷化氢并减少对单一熏蒸剂的依赖。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）触发的序列特异性基因沉默过程。昆虫摄入dsRNA后，其被加工为小干扰RNA并引导靶标mRNA降解，从而降低蛋白质水平并破坏必需生物学功能。根据靶基因和暴露条件的不同，RNAi可降低害虫的存活率、取食、发育或繁殖能力。由于dsRNA可设计出高度序列特异性，RNAi为选择性害虫防控提供了可能。口服递送对储粮害虫尤为适用，因为dsRNA可直接施用于粮粒或整合入储粮保护处理中。已有研究表明，基于dsRNA的策略可抑制包括谷蠹在内的储粮害虫，但仍存在若干障碍，如dsRNA在粮粒上的稳定性、在昆虫肠道中的降解、取食效率以及不同物种和种群间RNAi响应的差异。
将RNAi推向实际应用的关键一步是鉴定口服递送后仍保持有效性的靶基因。本研究选择了五个此前在赤拟谷盗（*Tribolium castaneum*）中报道为致死性RNAi靶标的候选基因：Ras opposite（ROP）、insulin receptor isoform A（INRA）、vacuolar ATPase subunit A（VATPA）、vacuolar ATPase subunit D（VATPD）和coatomer protein I（COPI）。这些基因在先前研究中产生了强烈的RNAi致死效应，并代表昆虫生存所必需的保守生物学功能。然而，这些靶标在谷蠹中是否保留强效口服RNAi活性，以及在不同磷化氢抗性水平的种群中其功效是否得以维持，尚不清楚。
### 二、研究内容与总体结论
研究人员选取2017至2019年间采集的三个谷蠹种群开展实验：GX种群（采自江苏省，抗性比率RR = 7.15，作为参考种群）、MJ种群（采自湖北省，RR = 11.28）和XD种群（采自四川省，RR = 1173.63，高度抗性种群）。抗性比率（resistance ratio，RR）以各种群半数致死浓度（LC??）与FAO推荐敏感参考LC??（8 μg L?1）的比值计算。三个种群均在实验室条件下以清洁小麦籽粒维持饲养，未接触磷化氢。
研究人员通过体外转录合成靶向五个候选基因的dsRNA，以细雾喷洒方式将dsRNA溶液施用于小麦籽粒，使成虫连续取食经处理的小麦。研究设置了10、40、100和300 ng μL?1四个浓度梯度（对应0.2、0.8、2.0和6.0 μg dsRNA g?1粮粒的施用量），以RNase-free水和靶向绿色荧光蛋白的dsGFP作为阴性对照。通过生存率测定、定量PCR（quantitative PCR，qPCR）转录本抑制验证、相对粮粒重量损失评估以及跨种群校正死亡率分析，系统评价了口服RNAi在谷蠹中的致死效应、靶基因沉默效果、储粮保护效益及在磷化氢抗性种群中的有效性。
研究得出以下总体结论：口服递送dsRNA在连续暴露条件下可显著降低谷蠹成虫存活率并减少粮粒损害；五个候选靶基因中，COPI在生存抑制和粮粒保护两个维度均展现出最稳定且最强的效果；qPCR证实口服dsRNA诱导了靶标特异性转录本抑制；在涵盖宽范围磷化氢抗性水平的三个种群中，口服RNAi效果均得以维持，包括抗性倍数超过1000的高度抗性种群。
### 三、主要关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：（1）基于已组装的谷蠹转录组鉴定同源基因序列，并通过系统发育分析确认其与赤拟谷盗直系同源基因的对应关系；（2）利用T7 RiboMAX? Express RNAi System进行体外转录合成dsRNA，通过琼脂糖凝胶电泳验证完整性，NanoDrop One分光光度计测定浓度；（3）采用细雾喷洒法将dsRNA溶液均匀施用于小麦籽粒，经40 °C烘干约2小时将水分调至12 ± 0.5%后立即用于生物测定；（4）成虫连续取食处理粮粒10天后统计存活率，并以每处理5个重复、每重复40头成虫的规模进行剂量效应评估；（5）通过定量PCR（qPCR）检测靶标转录本相对表达水平，以18S rRNA和RPL13a为内参基因，采用2?ΔΔCt法计算相对表达量；（6）以每处理6个重复、每重复10粒小麦称重的方式测定相对粮粒重量损失；（7）在跨种群验证中，以40 ng μL?1浓度处理3个磷化氢抗性水平不同的种群，分别在第3、7、10天记录死亡率，并以Abbott公式计算相对dsGFP对照的校正死亡率；（8）统计分析采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验（α = 0.05），在R软件（v4.2.2）中完成。
### 四、主要研究结果
#### 4.1 口服dsRNA对成虫存活率的剂量依赖性效应
成虫连续取食经dsRNA处理的小麦籽粒（10–300 ng μL?1）10天后，五个靶基因处理均表现出明确的剂量依赖性存活率下降，而水和dsGFP对照组的存活率始终高于90%。在10 ng μL?1低浓度下，第10天存活率介于61%（dsCOPI）至79%（dsVATPA）之间，表明低暴露水平下已有适度效应。将剂量提高至40 ng μL?1后，部分靶标产生较强的致死效果（dsCOPI存活率23%，dsVATPD存活率27%），而其他靶标仍处于中等水平（dsROP和dsVATPA存活率58–64%）。在100 ng μL?1浓度下，最有效靶标的存活率急剧下降，dsCOPI降至7%、dsINRA降至6%、dsVATPD降至8%、dsVATPA降至11%，而dsROP的相对致死效果较弱（存活率51%）。在300 ng μL?1最高浓度下，五种dsRNA在第10天均产生严重致死效应，存活率分别降至3%（dsCOPI）、5%（dsINRA）、5%（dsVATPD）、11%（dsVATPA）和12%（dsROP）。总体而言，dsCOPI在多个剂量水平下均产生最低存活率。
#### 4.2 dsRNA暴露后的靶标转录本抑制
在第3天时间点（300 ng μL?1）进行的qPCR检测证实，口服递送的dsRNA诱导了相应靶标转录本的显著抑制。各dsRNA主要降低其预期靶标的表达，对其他检测基因的脱靶抑制有限。靶标mRNA水平相对对照组分别降至：dsROP为25%、dsINRA为48%、dsVATPA为15%、dsVATPD为34%、dsCOPI为42%。这些结果确证了口服dsRNA在实验条件下诱导了靶标特异性转录本抑制。尽管转录本水平在第3天测定而死亡率在第10天评估，但所观察到的基因敲低与RNAi介导的基因沉默对后续生物效应的贡献是一致的。
#### 4.3 口服dsRNA降低相对粮粒重量损失
口服dsRNA暴露也减少了以第10天相对粮粒重量损失为指标的粮食品质损害。对照处理（水和dsGFP）普遍表现出较高的粮粒损失，反映了10天内持续的取食活动。相对粮粒重量损失（%）随dsRNA浓度升高而普遍下降。在40 ng μL?1下，dsCOPI和dsROP分别将粮粒损失降至45%和72%，而dsVATPA和dsINRA几乎没有减少（93–98%）。在100 ng μL?1下，dsCOPI的粮粒保护效果最强，粮粒损失降至6%，其后为dsROP（42%）和dsVATPD（44%），dsINRA和dsVATPA仍相对较弱（80–91%）。在300 ng μL?1下，dsROP（12%）、dsINRA（21%）、dsCOPI（8%）和dsVATPD（11%）均大幅降低了粮粒损失。粮粒损失减少可能同时反映了死亡率升高和取食活动的亚致死效应，但该研究未直接测定取食行为。
#### 4.4 基于校正死亡率的磷化氢抗性种群有效性
为评估口服RNAi功效是否在不同磷化氢抗性水平的种群中得以维持，研究者在三个涵盖宽抗性范围的谷蠹种群中于40 ng μL?1浓度下评估了dsRNA活性：GX（参考种群）、MJ（低水平抗性）和XD（高度抗性，RR = 1173.63）。死亡率以相对dsGFP对照的Abbott校正死亡率（%）表示。三个种群的校正死亡率均随时间推移而增加。到第10天，GX种群校正死亡率达到77%，MJ种群为72%，XD种群为82%，表明即使在高度磷化氢抗性种群中也保持了强效RNAi活性。这一结果支持RNAi作为抗性管理中补充性作用模式的潜力。
### 五、讨论与结论总结
本研究证明口服RNAi可降低谷蠹的成虫存活率和粮粒损害，且这些效应在磷化氢抗性水平显著不同的种群中得到维持。更重要的是，研究结果表明多个在赤拟谷盗中鉴定的致死性RNAi靶标在转移到谷蠹后仍保留活性。然而，五个候选基因的表现并不均等，这突显了靶标选择对实际RNAi害虫治理的重要性。COPI在多个浓度下对存活率和粮粒保护两个指标均产生稳定且强烈的效应，这可能与其参与细胞内囊泡运输这一基础细胞过程有关。VATPA和VATPD作为液泡ATP酶复合物的组分，其破坏预期影响质子转运、离子稳态和能量依赖的生理功能，这解释了其相对较强的表型效应。相比之下，部分靶标产生了可测量的转录本抑制但致死响应较为温和，表明转录本敲低程度并不总能直接预测表型严重程度。
从储粮保护的角度看，粮粒保护通常比死亡率更具实际意义，因为经济损失源于累积的取食损害。研究发现粮粒损失减少并不总是与死亡率成比例，提示口服RNAi可能通过致死和亚致死双重效应减少粮食品质损害——除致死外，沉默必需基因还可能损害取食活动、营养利用、运动能力或其他影响粮粒消耗的生理功能。
跨种群实验的关键发现是，校正死亡率在三个种群中均保持在较高水平，包括RR超过1000的高度抗性XD品系。但研究者在讨论中谨慎指出，磷化氢抗性与RNAi敏感性涉及根本不同的生物学过程，且跨种群实验仅评估了单一靶标和单一暴露浓度，因此该结果只能说明在测试条件下磷化氢抗性并未阻止有效的RNAi介导防控。
从实际应用角度，RNAi类储粮保护剂可能最适合作为针对性处理而非整仓施用，例如施用于粮粒表面或害虫最易侵入的顶层，从而在保持防护效果的同时减少所需材料用量。微生物dsRNA生产、体外合成和制剂技术的持续进步预期将改善RNAi害虫管理策略的经济可行性。
研究结论为：口服递送dsRNA在连续暴露条件下降低了谷蠹成虫存活率和粮粒损害；在评估的候选基因中，COPI在生存抑制和粮粒保护两个方面均持续产生强效作用；靶标转录本抑制证实了口服dsRNA诱导了RNAi活性；在涵盖宽范围磷化氢抗性水平的种群中功效得以维持。综合来看，这些发现支持口服RNAi作为储粮害虫管理补充性工具的潜力，并证明了将模式甲虫中鉴定的致死性RNAi靶标转移到谷蠹的可行性。
