外周神经特异性自身免疫的效应记忆CD4+ T细胞跨血-神经屏障迁移机制：MHC II类分子介导的分子模拟重定义

《Frontiers in Neurology》：Mammalian peripheral nerve specific autoimmunity: proposed mechanisms and redefinition of molecular mimicry

　　

摘要专业翻译 分子模拟（molecular mimicry）被认为是外周神经特异性自身免疫的关键机制：该过程假设，机体主要因感染携带与外周轴突复合神经节苷脂或外周神经髓鞘蛋白具有相似表位的细菌或病毒而产生系统性抗体，这些抗体在遗传易感个体中诱导外周神经损伤。人体体外（in vitro）研究提出，近期活化的抗原特异性效应记忆CD4+ T细胞通过T细胞受体（T cell receptor, TCR）驱动的跨内皮迁移，在局部微血管活化后启动组织特异性自身免疫。然而，这些稀有T细胞如何从次级淋巴器官定向迁移至外周神经及神经根以启动自身免疫反应，其机制尚不清楚。研究人员利用重症小鼠实验性自身免疫性神经炎（severe murine experimental autoimmune neuritis, sm-EAN）作为外周神经特异性自身免疫的动物模型，通过条件性基因敲除转基因小鼠阐明，神经内膜内皮细胞上的主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）II类分子表达是疾病发生所必需的。这一发现提示，表达特异性抗原的MHC II类分子的血-神经屏障（blood-nerve barrier, BNB）细胞可作为抗原特异性效应记忆CD4+ T细胞跨内皮迁移的方向性线索：这是一个主动的、分子依赖的、协调的多步骤机制范式，用以启动组织特异性自身免疫并驱动随后的单核细胞和B细胞浸润，导致外周神经脱髓鞘和轴突变性。基于上述初步观察，研究人员提出对分子模拟进行如下重定义：近期活化的抗原特异性效应记忆CD4+ T细胞在免疫监视过程中，与表达MHC II类分子且呈递相同加工抗原肽序列的微血管内皮细胞发生结合，从而触发其跨内皮迁移并启动组织特异性自身免疫的过程。

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一、研究背景与问题

自身免疫性疾病影响全球约3%–5%的人口，且发病率和患病率持续上升，仅美国每年的直接医疗费用就保守估计超过1000亿美元。尽管在自身免疫性疾病的发病机制、诊断和治疗方面取得了显著进展，但在外周神经特异性自身免疫性疾病如吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome, GBS）领域，进展相对有限。GBS是一种严重的自身免疫性疾病，可导致不同程度的肌无力、感觉丧失、自主神经功能障碍和心肺功能受损，男女患病比例约为1.3:1，且患病率随年龄增长而增加。与可能伴随系统性自身免疫疾病发生的慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病（chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy, CIDP）和血管炎性神经病不同，GBS的病变局限于外周神经和神经根，因此是理解外周神经及神经根组织特异性自身免疫发生机制的理想模型。

分子模拟被认为是GBS发病的核心机制：病原体（细菌或病毒）表达与外周神经抗原具有分子相似性的表位，机体为清除病原体而产生的免疫反应 inadvertently 导致外周神经和神经根的脱髓鞘及轴突损伤。然而，大多数暴露于这些病原体的个体并不会发展为GBS，遗传易感因素被用来解释患者的选择性。值得注意的是，全球最常见的GBS变异型——急性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病（acute inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy, AIDP）的确切致病性抗体至今未明，CIDP及其变异型也是如此。GBS中MHC或人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）II类易感风险基因尚未被明确鉴定。基于细胞因子谱分析、体外T细胞筛选、单细胞RNA测序和T细胞受体（TCR）测序，越来越多的证据表明AIDP-GBS与靶向外周神经髓鞘抗原的、具有T辅助1型（Th1）样表型的自身反应性效应记忆CD4⁺ T细胞相关，提示CD4⁺ T细胞在该自身免疫性疾病中发挥重要的致病作用。

AIDP变异型GBS患者神经活检的组织病理学评估支持血源性白细胞向神经内膜的迁移，观察到单核细胞/巨噬细胞、CD4⁺和CD8⁺ T细胞以及B细胞/浆细胞浸润，伴随脱髓鞘和轴突变性。重要的是，在AIDP的致病性白细胞迁移过程中，神经内膜内皮细胞间存在电子致密的细胞间连接（提示紧密连接），支持白细胞穿越微血管是一个主动的、分子驱动的、协调的序贯过程（即白细胞迁移的多步骤范式），而非被动地通过“渗漏”的血-神经屏障（BNB）发生。

二、研究目的与核心问题

抗原特异性效应白细胞在外周神经自身免疫过程中定向迁移至外周神经的初始方向性线索尚不清楚。在次级淋巴器官中产生的近期活化的效应记忆CD4⁺ T细胞，如何高效地仅迁移至外周神经和神经根以诱导脱髓鞘和轴突变性，而不损伤其他组织或器官？既往人体体外和离体（ex vivo）研究表明，效应记忆CD4⁺ T细胞（特征为CD4⁺ CD25^? CD44⁺ CD45RA^? CD45RO⁺ CD62L^? CD127⁺）在局部微血管被炎性细胞因子和病原体相关或损伤相关分子模式激活后迁移至组织。这些研究使用培养的真皮、肺或脑微血管内皮细胞层，证明在静态或流动条件下，初始抗原特异性CD4⁺ T细胞跨内皮迁移依赖于内皮细胞MHC II类抗原呈递。效应记忆CD4⁺ T细胞形成TCR驱动的跨内皮突起被证明是在流动条件下快速跨微血管内皮细胞层旁细胞迁移的初始步骤。在Lewis大鼠过继转移实验性自身免疫性神经炎（EAN）模型中，只有高度活化的致神经炎性髓鞘外周神经肽P2_55-78反应性T细胞而非非特异性T细胞能够穿越BNB，提示BNB处神经内膜内皮细胞与抗原特异性T细胞的相互作用是外周特异性自身免疫体内发生的必要条件。

研究人员前期工作显示，人类神经内膜内皮细胞在原位和体外均表达多种HLA-D转录本和非专职抗原呈递细胞的组成性转录本谱，提示人类神经内膜内皮细胞可能在生理和致病性免疫反应中充当兼性抗原呈递细胞（antigen presenting cell, APC）。然而，体外迁移研究不能完全重现体内微血管中发生的情况。在AIDP变异型GBS和CIDP患者神经活检中，与无炎性神经病对照组相比，单核细胞/巨噬细胞、施万细胞、浸润T细胞、神经束膜细胞和形成BNB的神经内膜内皮细胞上MHC II类（HLA-D）表达均增加。但GBS患者的神经活检通常不在疾病发作时进行，因此这些观察性研究无法阐明外周神经MHC II类表达是否为GBS发病所必需，以及在何种细胞类型上的表达具有致病意义。

三、研究设计与主要技术方法

为确定内皮细胞MHC II类表达是否为体内组织特异性自身免疫所必需，研究人员选用雌性SJL小鼠的重症小鼠实验性自身免疫性神经炎（sm-EAN）模型作为AIDP变异型GBS的外周神经特异性自身免疫范例。该模型通过接种牛外周神经髓鞘乳化于完全弗氏佐剂中，并以百日咳毒素和重组小鼠白细胞介素-12作为共佐剂诱导，驱动急性、自限性的CD4⁺ T辅助1型介导的炎性脱髓鞘和轴突变性。8–12周龄雌性小鼠100%发病，疾病严重程度在诱导后7–10天达到高峰。

关键技术方法包括：（1）构建MHC II类Aα链条件性基因敲除（H2-Aa^flox/flox）SJL小鼠品系（SJL.B6-H2-Aa^{tm1c(KOMP)Wtsi}/UbeeMmmh; RRID: MMRRC_071292-MU），该品系由初始C57BL/6-H2-Aa^{b-tm1c(KOMP)Wtsi}/UbeeMmmh品系通过速度同源育种（speed congenics）培育而来；（2）构建他莫昔芬（Tamoxifen）诱导型半合子血管性血友病因子Cre重组酶（vWF-iCre/+）转基因SJL小鼠品系（SJL Cg-Tg(VWF-Cre/ERT2)C1014/UbeeMmmh; RRID: MMRRC_071293-MU），利用含734碱基对微血管内皮细胞特异性启动子序列的人vWF基因组DNA片段驱动Cre重组酶表达；（3）将两种品系杂交，获得他莫昔芬诱导型微血管内皮细胞特异性MHC II类条件性基因敲除SJL小鼠品系（H2-Aa^flox/flox; vWF-iCre/+），该构建体选择性切除Cre重组酶表达细胞中的外显子2、3、4和外显子5的5′部分，产生无功能的H2-Aa蛋白；（4）在最大程度他莫昔芬诱导基因重组后，对11–12周龄雌性SJL小鼠通过皮下注射牛外周神经髓鞘（BPNM）乳化于完全弗氏佐剂（CFA）中，并以百日咳毒素和重组小鼠白细胞介素（IL）-12作为共佐剂诱导sm-EAN；（5）每日进行体重测量和使用已发表的神经肌肉严重程度量表（NMSS）进行神经行为评估，在诱导后第28天（疾病严重程度高峰期）进行运动神经电生理学研究，并采集坐骨神经、腹股沟淋巴结和脾脏。

四、研究结果

微血管内皮细胞MHC II类表达在外周神经特异性自身免疫体内模型中的直接功能证据

他莫昔芬处理的雌性H2-Aa^flox/flox; vWF-iCre/+ SJL小鼠（微血管内皮细胞H2-Aa缺失）在疾病诱导后长达30天内维持正常体重，基于NMSS评估未发生sm-EAN，坐骨神经和背尾神经运动电生理正常，坐骨神经和背尾神经无炎症、脱髓鞘或轴突丢失的组织学证据。研究人员还观察到白细胞存在于坐骨神经和背尾神经外部的结缔组织中，表明白细胞具有浸润能力，但未能跨内皮迁移至外周神经。他莫昔芬处理的雌性H2-Aa^flox/flox; vWF-iCre/+ SJL小鼠的骨髓、淋巴结和脾脏MHC II类表达通过间接荧光免疫组织化学检测均正常。该研究提供了微血管内皮细胞MHC II类表达是鼠外周神经特异性自身免疫先决条件的初步证据，提示MHC II类为抗原特异性效应记忆CD4⁺ T细胞在自身免疫过程中跨BNB迁移提供了方向性线索。在开发SJL小鼠品系时，研究人员观察到SJL和C57BL/6小鼠H2-Aa外显子2在转基因插入位点5′端存在序列差异，这可能解释了对EAN的差异易感性。

五、讨论与结论

研究结果表明，微血管内皮细胞特异性H2-Aa敲除阻止了成年雌性SJL小鼠的急性自身免疫性脱髓鞘性神经炎，提示BNB处内皮细胞MHC II类表达是抗原特异性外周神经限制性自身免疫所必需的。这一发现支持了人体体外研究中血管内皮细胞促进抗原呈递、效应记忆T细胞增殖和抗原特异性CD4⁺ T细胞迁移的能力，以及过继转移Lewis大鼠EAN中高度活化的外周神经致病性T细胞选择性穿越BNB的现象。重要的是，他莫昔芬处理的H2-Aa^flox/flox; vWF-iCre/+ SJL小鼠骨髓或次级淋巴器官中的白细胞H2-A表达未出现意外改变，表明启动对外源抗原适应性免疫反应所需的专职APC功能未受干扰。

SJL小鼠适应性免疫反应依赖H2-Aa，因为这些小鼠为H2-Ea缺失，且β链分子存在冗余性。H2-Aa（人类同源物为HLA-DQA1）在物种间高度保守，提示其在适应性免疫中具有重要作用。多态性（如外显子2处）可能解释SJL和C57BL/6小鼠对sm-EAN的差异易感性。尽管GBS中尚未确定确切的HLA II类易感风险基因，HLA-DQA1是全球AIDP-GBS患者队列深度测序的合理靶点。

基于既往发表的体外研究和人类BNB转录组数据及单细胞RNA测序数据，研究人员提出以下机制模型：近期活化的效应记忆CD4⁺ T辅助1型细胞通过P-选择素-P-选择素糖蛋白配体-1相互作用在微血管内皮细胞表面滚动，并通过趋化因子受体CX3CR1与神经内膜微血管腔面组成性表达的CX3CL1结合发生趋化运动（haptotaxis）。抗原呈递通过内皮细胞MHC II类（α链依赖）分子作用于效应记忆CD4 Th1 TCR。若不匹配，效应记忆细胞脱离并继续前行；若匹配，则发生共刺激（如通过CD40L-CD40、ICOS-ICOSL相互作用），进一步激活效应记忆CD4⁺ T细胞，通过构象变化将其非活性整合素（如CD11b和CD49d）转化为活性整合素。这些活化整合素与组成性表达的黏附分子（如ICAM-1和VCAM-1）结合导致牢固黏附，进而通过T细胞与内皮细胞CD99之间的同嗜性相互作用实现旁细胞跨内皮迁移（diapedesis）。这些效应记忆CD4⁺ Th1细胞可在神经内膜内自由迁移，释放细胞因子并激活内源性巨噬细胞以启动自身免疫反应。

条件性H2-Aa敲除小鼠品系为研究不同细胞在组织或器官特异性适应性免疫反应中的抗原呈递提供了重要工具，他莫昔芬诱导的Cre重组可有效实现基因删除与自身免疫疾病模型阶段（即起始、进展、恢复等）的时间匹配。此类研究有助于确定MHC II类在胃肠道和呼吸道上皮黏膜免疫中的作用，并确定血脑屏障微血管内皮细胞MHC II类表达是否为自身免疫性神经炎症起始或仅限于扩增所必需。来自微血管内皮细胞特异性MHC II类敲除小鼠的组织或器官移植物可为同种异体移植和异种移植排斥提供见解。使用免疫系统完整的活体小鼠进行研究优于人体体外和离体研究，前提是此类研究以特征明确的患者数据为指导。从条件性MHC II类敲除小鼠研究中获得的关于分子模拟、组织特异性自身免疫和移植排斥的深入理解，应能推动知识进步并指导超越外周神经的靶向免疫药物开发策略。

研究结论：微血管内皮细胞MHC II类表达是外周神经特异性自身免疫体内发生的先决条件，MHC II类分子通过呈递与初始激活抗原相同的加工肽序列，为抗原特异性效应记忆CD4⁺ T细胞提供跨BNB定向迁移的方向性线索，从而启动组织特异性自身免疫。基于此，研究人员提出将分子模拟重定义为：近期活化的抗原特异性效应记忆CD4⁺ T细胞在免疫监视过程中，与表达MHC II类分子且呈递相同加工抗原肽序列的微血管内皮细胞发生结合，从而触发其跨内皮迁移并启动组织特异性自身免疫的过程。