《Frontiers in Immunology》：Dissecting the mechanism of action of the adjuvant system AS01 in human immune cells: synergy of QS-21 and monophosphoryl lipid A and role of type I interferons
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佐剂系统AS01由Toll样受体4（TLR4）激动剂单磷酰脂质A（MPLA）和嵌入脂质体中的皂苷QS-21组成，目前用于针对带状疱疹、呼吸道合胞病毒感染和疟疾的重组疫苗。这些疫苗的功效归因于AS01的强免疫刺激效应。尽管临床前研究已揭示了AS01增强免疫应答的
佐剂系统AS01由Toll样受体4（TLR4）激动剂单磷酰脂质A（MPLA）和嵌入脂质体中的皂苷QS-21组成，目前用于针对带状疱疹、呼吸道合胞病毒感染和疟疾的重组疫苗。这些疫苗的功效归因于AS01的强免疫刺激效应。尽管临床前研究已揭示了AS01增强免疫应答的机制，但利用人类免疫细胞来剖析这两种免疫刺激剂分别及组合作用的研究很少。研究人员研究了AS01对人THP-1细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）的作用，发现其诱导了一组广泛的趋化因子和数量有限的细胞因子的分泌。在趋化因子中，CCL3和CCL4的倍数增加最大。抑制TLR4信号传导显示对TLR4具有不同程度的依赖性，而用含有TLR4激动剂、QS-21或两者配制的脂质体进行的实验证明，对许多趋化因子和TNF的诱导具有协同效应。AS01诱导了干扰素刺激基因的强烈表达；用阻断I型干扰素（IFN）受体的抗体处理可大幅降低该表达，表明AS01诱导了一种部分依赖于经由I型干扰素受体信号传导的I型IFN相关转录特征。AS01选择性增加了THP-1细胞上CD83的表达，且发现该效应主要由QS-21驱动。这项工作为AS01刺激人类免疫细胞的机制提供了新的见解。
**论文解读：AS01佐剂系统在人类免疫细胞中的作用机制**
**研究背景与目的**
佐剂系统AS01由TLR4激动剂单磷酰脂质A（MPLA）和皂苷QS-21组成，二者被包封在脂质体中，现已被用于带状疱疹、呼吸道合胞病毒感染和疟疾的重组疫苗。这些疫苗的良好效力很大程度上归因于AS01的强免疫刺激效应。虽然临床前研究已在一定程度上揭示了AS01增强免疫应答的机制，但直接利用人类免疫细胞、分别剖析MPLA和QS-21各自及联合作用的实验仍十分有限。此外，人类和小鼠的免疫系统存在差异，例如MPLA对人TLR4的激活模式不同于小鼠，因此有必要在人体细胞中研究AS01的作用机制（mechanism of action，MoA）。既往对PBMCs的研究显示，AS01可诱导单核细胞表达TNF和IL-1β，但未观察到T细胞或自然杀伤（NK）细胞产生IFN-γ。为更全面理解AS01在人体中的效应，研究人员采用人单核细胞系THP-1和混合供者的人外周血单个核细胞（PBMCs），系统分析了AS01诱导的趋化因子、细胞因子和生长因子分泌谱、TLR4信号参与程度、QS-21与MPLA的协同关系、I型干扰素（IFN）相关转录特征以及细胞表面共刺激分子的变化。
**主要技术方法**
研究人员使用人THP-1单核细胞系和来自5名健康供者混合的PBMCs（购自HumanCells Biosciences），以商业化AS01B（源自带状疱疹疫苗SHINGRIX?）和系列合成脂质体变体（空脂质体、LP-QS-21、LP-PHAD、LP-QS-21/PHAD）为刺激物。通过96重磁珠多重检测技术同时测定30种趋化因子和66种细胞因子/生长因子；ELISA定量TNF和IL-1β；LDH释放实验评估细胞毒性。采用TLR4抑制剂TAK-242、抗TLR4中和抗体以及抗I型干扰素受体亚基1（IFNAR1）阻断抗体进行通路干预。使用定量逆转录PCR（qRT-PCR，以2
-ΔΔCq法分析）检测干扰素刺激基因（ISGs）表达，Western blot检测STAT1和STAT6磷酸化，流式细胞术分析CD83等表面标志物，并利用HEK-Blue? hTLR4和THP-1 Dual?报告细胞评估TLR4、NF-κB和IRF通路激活。
**研究结果**
**1. 确定最佳AS01刺激条件**
研究人员通过比较不同稀释度（50%起）和不同孵育时间（6、24、48小时）下THP-1细胞分泌TNF和IL-1β的水平，发现AS01以剂量依赖方式诱导TNF分泌，24小时达峰，且未检测到明显的乳酸脱氢酶（LDH）释放，说明无显著细胞膜损伤。据此确定以12.5% AS01刺激24小时作为后续实验条件。
**2. AS01诱导广泛的趋化因子应答和有限的细胞因子应答**
在THP-1细胞中，AS01显著增加10种趋化因子分泌，其中CCL4的上升幅度最大（接近1000倍），CCL3和CCL4的倍数增加最高；66种细胞因子/生长因子中仅6种显著升高，且浓度较低。在混合PBMCs中，AS01显著增加15种趋化因子和12种细胞因子/生长因子，包括促炎性IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF和抗炎性IL-1RA、IL-10。该结果证实AS01在人类髓系细胞中诱导以趋化因子为主的广泛分泌谱。
**3. AS01在THP-1细胞中参与TLR4信号通路**
预先加入TLR4抑制剂TAK-242可使AS01诱导的多种趋化因子和细胞因子分泌受到不同程度抑制（0%至88.3%），抗TLR4抗体进一步验证了对TNF分泌的部分抑制作用。在报告细胞实验中，AS01能激活人TLR4报告细胞及THP-1 Dual细胞中的NF-κB和IRF信号通路，但信号强度低于LPS。有趣的是，AS01单独诱导IL-1β分泌很弱，需要先用LPS预启动才能显著增加IL-1β释放，提示AS01虽可激活TLR4但作用相对温和。
**4. QS-21与TLR4激动剂在脂质体中的协同作用**
空脂质体不能诱导显著的趋化因子和细胞因子分泌。与单独使用LP-QS-21或LP-PHAD相比，含有两种免疫刺激剂的LP-QS-21/PHAD可显著增强CCL2、CCL3、CCL4、CCL8、CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11以及TNF的分泌，表现出明确的协同效应。尤其CCL4的分泌量约达到两种单独成分之和的40倍，表明QS-21与TLR4激动剂在诱导特定趋化因子方面存在强协同。
**5. AS01诱导I型干扰素和干扰素刺激基因表达**
AS01显著上调抗病毒ISGs（IFIH1、ISG15、MX1、OAS1）以及STAT1、IFNB、IFNG、IRF7的mRNA水平，并诱导STAT1酪氨酸磷酸化，但未检测到STAT6磷酸化。尽管培养上清中未测到游离I型IFN，但阻断IFNAR1后，大多数ISGs以及IFNG、CXCL10、IRF7的表达明显降低，而IFNB mRNA表达不受影响。这表明AS01可直接诱导IFNB转录，并通过I型IFN受体介导的自分泌/旁分泌信号放大部分ISG反应。
**6. AS01诱导THP-1细胞表达树突状细胞成熟标志物CD83**
流式细胞术显示，AS01不改变THP-1细胞表面CD40、CD54、CD80、CD86的表达，但显著上调CD83。分别测试脂质体变体后发现，LP-QS-21诱导CD83的能力与AS01及LP-QS-21/PHAD相近，且强于LP-P
