《Frontiers in Oncology》：Developmentally relevant proteins contribute to chemotherapeutic resistance in neuroblastoma
背景： 儿童肿瘤发生过程中的促进因子与抑制因子包括许多对发育至关重要的蛋白质和过程。神经母细胞瘤是一种起源于神经嵴细胞（这些细胞最终将定居于交感神经系统）的儿童癌症。在神经嵴发育的调控因子和效应因子中，包括神经营养因子受体TrkA、TrkB、TrkC及p75NTR；转录因子SIX1和ATF5；酪氨酸激酶ALK；以及组蛋白修饰酶EZH2和HDAC。在神经发育过程中，这些蛋白质的相对细胞表达、激活和转位在细胞命运决定中发挥重要作用。研究人员假设这些蛋白质在神经母细胞瘤的化疗耐药中也发挥重要作用。
目的： 本综述探讨现有证据，以 implicating 这些发育相关蛋白及其时空不稳定性在神经母细胞瘤化疗耐药挑战中的作用。
文献综述方法： 为研究发育相关机制在神经母细胞瘤化疗耐药中的作用，研究人员在PubMed和ClinicalTrials.gov数据库中进行了检索，使用的检索词包括：“neurotrophin receptor” AND “neuroblastoma”；“Trk” AND “neuroblastoma”；“p75NTR” AND “neuroblastoma”；“EZH2 inhibitors” AND “neuroblastoma”；“HDAC inhibitors” AND “neuroblastoma”；“epigenetic” AND “neuroblastoma” AND “resistance”；“ALK inhibitors” AND “neuroblastoma”；“PRMT” AND “neuroblastoma”；以及“neuroblastoma differentiation” AND “therapy”。过去10年内发表的论文被考虑纳入关于神经母细胞瘤细胞和临床肿瘤对化疗药物反应的讨论，而过去5年内已停止招募或仍在继续招募的临床研究被考虑纳入关于临床神经母细胞瘤未来治疗方法的讨论。
文献证据综合： 在所有初始主题中共识别出317篇论文，其中195篇被发现与神经母细胞瘤治疗相关。11篇论文被识别为与2个或更多主题相关（8篇论文涉及2个主题；2篇论文涉及3个主题；1篇论文涉及6个主题），最终共识别出175篇独特论文。文献支持以下观点：神经母细胞瘤中特定蛋白质表达、激活和转位的发育驱动异质性和可变性， contributes to 神经母细胞瘤对化疗的难治性。
结论： 旨在抑制或表观遗传修饰瘤内神经营养因子受体、转录因子、酪氨酸激酶和组蛋白修饰酶的治疗方法目前正在进行神经母细胞瘤的临床试验。未来的努力将需要个体化治疗和新兴技术方法，以应对神经母细胞瘤中发育相关蛋白表达和加工的异质性与不稳定性。
论文主体内容总结
1 引言
成人癌症通常被视为环境因素对完全分化的成熟细胞造成“打击”的结果，有时也涉及遗传易感性与“二次打击”机制。相比之下，幼儿尤其是新生儿和婴儿的癌症，更常被视为未分化细胞发育停滞的结果，通常与特定谱系内分化调控因子和蛋白质表达的遗传或表观遗传异常相关。因此，细胞在致癌性发育停滞时所处的分化阶段具有变异性，且这些细胞保留继续增殖和转移的潜力，并在新环境中采用发育上不同的转录组，这为确定儿童癌症有效化疗的治疗靶点带来了独特挑战。本综述以神经母细胞瘤（一种源自发育中神经嵴细胞的常见儿童癌症）为例，阐述这些挑战及克服这些挑战的部分尝试。
2 文献综述方法
为研究发育相关机制在神经母细胞瘤化疗耐药中的作用，研究人员在PubMed和ClinicalTrials.gov数据库中进行了系统检索，使用多项特定检索词组合。过去10年内发表的论文被考虑纳入关于神经母细胞瘤细胞和临床肿瘤对化疗药物反应的讨论，而过去5年内已停止招募或仍在继续招募的临床研究被考虑纳入关于未来治疗方法的讨论。共识别出317篇论文，其中195篇与神经母细胞瘤治疗相关。11篇论文与多个主题相关，最终确定175篇独特论文。所有175篇论文均被审阅以得出本综述结论。
3 神经母细胞瘤：一种儿童发育性癌症
3.1 胚胎学与临床方面
神经母细胞瘤是儿童最常见的实体瘤，起源于神经嵴中的神经母细胞前体细胞，这些细胞最终迁移形成交感神经系统，包括肾上腺的神经内分泌成分。约50%的原发肿瘤位于肾上腺，25%位于腹部其他部位，其余位于胸部和颈部。诊断时中位年龄为17个月。与成人癌症不同，神经母细胞瘤可被视为细胞成熟异常，其细胞“停滞”在中间分化阶段。神经嵴细胞迁移过程中，每个阶段和环境诱导不同的细胞蛋白表达及形态功能特征，这种时空异质性和可塑性增加了设计靶向治疗的难度。国际神经母细胞瘤风险组分期系统用于评估疾病严重程度，其他因素如诊断年龄、组织学、分化程度、倍性、MYCN癌基因扩增状态及11q染色体畸变也用于预测疾病侵袭性。预后呈双峰分布：1岁以下患儿生存率更高；MYCN过表达者预后更差；低中危（L1或L2期）5年总生存率为90-95%，而远处转移（M期）约为50%。
3.2 神经母细胞瘤治疗耐药的挑战
神经嵴发育和分化的许多特征 contributes to 神经母细胞瘤细胞的化疗耐药。神经嵴细胞迁移过程中经历上皮-间质转化，涉及一系列转录因子表达的表观遗传变化。交感-肾上腺祖细胞是神经母细胞瘤的起源细胞，根据起源细胞的分化阶段和性质，可产生不同类型肿瘤，每种类型具有独特的表达谱和治疗靶点。化疗对某一谱系的选择性以及这些细胞类型在表观遗传上相互转化的潜力，也在化疗耐药中发挥作用。许多参与分化和致癌转化的蛋白是转录因子，具有众多不同下游靶点，使其成为具有挑战性的治疗靶点。MYCN癌基因在原始神经嵴细胞中表达，在EMT过程中下调，但在交感-肾上腺祖细胞中重新表达，这 contributes to 肿瘤发生、毒力和化疗耐药。此外，交感-肾上腺谱系细胞表达神经营养受体和下游信号转导因子，介导氧化应激抵抗和细胞生死决策，这些因子也参与对细胞毒性化疗药物的抵抗。
4 神经母细胞瘤治疗耐药中发育相关的介质：神经营养因子受体
4.1 神经营养因子及其受体的发育表达与功能
神经嵴细胞的分化和维持主要由两种神经营养因子受体及其配体介导。TrkA是高亲和力受体，结合神经生长因子（NGF），通过NGF-TrkA-Ras-Raf-MEK1-ERK1/2-CREB通路介导神经母细胞分化和存活。p75NTR功能更复杂，最初被视为增强TrkA对NGF亲和力的“共受体”，后被发现可独立信号传导，主要作为“死亡受体”，与sortilin结合proNGF诱导神经嵴来源细胞凋亡。p75NTR的功能取决于其与TrkA的相对丰度及环境中NGF和proNGF的浓度。TrkB结合脑源性神经营养因子（BDNF），TrkC结合神经营养因子-3（NT-3）。TrkA也可低亲和力结合NT-3。在交感神经系统发育过程中，TrkA表达增加诱导Arf6激活，促使p75NTR转运至细胞膜并与TrkA结合，将信号从NT-3转向NGF。p75NTR可独立结合BDNF、NT-3和NT-4/5，被称为“混杂”神经营养因子受体。TrkA过表达可将信号从抗凋亡通路转向促凋亡通路。
4.1.1 TrkA、TrkB和TrkC的发育表达与信号传导
NTRK1基因编码的TrkA在颅神经节、脊神经节和椎旁交感神经元中终生表达。TrkA-NGF复合物主要通过三条通路信号传导：Ras和PI3K通路主要促进细胞存活，PLCγ通路主要促进神经元分化和 neurite 生长。TrkB在早期胚胎中主要由基板来源细胞表达，但在神经嵴细胞分化为交感神经元及随后腹侧迁移形成交感神经节期间存在表达窗口。TrkB-BDNF信号传导使细胞能够迁移，并在转移性神经嵴来源癌症中被利用和持续。发育中的交感神经母细胞包括早期出现的共表达TrkA和TrkC但不表达TrkB的细胞，以及后期出现的表达TrkB的细胞。
4.1.2 p75NTR的发育表达与信号传导
p75NTR是神经营养因子受体中最复杂和多面的，与多种蛋白结合。它与各Trk受体作为共受体，增强Trk受体对其配体的亲和力。p75NTR与sortilin结合proNGF或proBDNF导致凋亡。p75NTR还与Nogo家族受体结合髓鞘相关糖蛋白等，抑制轴突生长。p75NTR与不同伙伴的复合物形成依赖于多种其他蛋白的参与，如Kidins220/ARMS参与细胞骨架重塑。
4.2 神经营养因子及其受体在神经母细胞瘤化疗耐药中的推定作用
临床观察表明，TrkA或TrkC高表达肿瘤预后较好，而TrkB高表达预后较差。TrkA和TrkC高表达肿瘤更可能发生神经分化或自发消退，而TrkB高表达肿瘤更可能向间皮（基质）谱系转化，对化疗更耐药，更易诱导血管生成和转移。利用这些观察进行治疗面临多重挑战：受体功能依赖于膜和细胞外环境；致癌转化伴随表观基因组现象；化疗应激可诱导TrkA选择性剪接产生不依赖配体的组成性信号；肿瘤内细胞成熟阶段异质性使靶向治疗困难。
4.2.1 Trk和p75NTR信号传导的细胞内和细胞外环境依赖性及神经母细胞瘤化疗耐药
Trk和p75NTR表达影响肿瘤细胞增殖、凋亡、炎症免疫反应、迁移和血管生成。高TrkB表达增强血管生成并降低化疗敏感性，细胞沿间充质样基质谱系进展，BDNF结合激活ERK、AKT和mTORC1通路，稳定Bcl-2、MCL-1和BCL-xL抗凋亡。高TrkA表达增强分化和 neurite 生长，降低增殖。MS期神经母细胞瘤（<18个月，转移限于肝、骨髓和/或皮肤）高表达TrkA，倾向于自发消退；而M期肿瘤高表达TrkB，预后差。研究比较了<18个月患者的MS和M期肿瘤表达谱，差异最大的基因涉及细胞死亡机制，MS期肿瘤具有凋亡和铁死亡易感性特征。
4.2.2 Trk表达的表观遗传修饰
NTRK基因特别容易在CpG富集区发生胞嘧啶甲基化抑制。所有NTRK基因和NGFR基因结合的抑制性组蛋白以PRMT介导的蛋白甲基化为特征。N-myc蛋白是NTRK1和NGFR基因的转录抑制因子，阻止分化凋亡。PRMT还通过精氨酸甲基化激活EYA1磷酸酶，活化的EYA1使转录因子SIX1去磷酸化，Me-EYA1-SIX1复合物对颅神经母细胞分化至关重要，但也转录促进MYCN癌基因。PRMT甲基化N-myc蛋白延长其半衰期，导致N-myc积累，加剧对NTRK1和NGFR的抑制。
4.2.3 细胞应激诱导TrkA选择性剪接
肿瘤缺氧、炎症和化疗氧化效应可诱导产生TrkAIII剪接变体，缺失外显子6、7和9。与天然TrkA不同，TrkAIII启动不依赖配体的组成性信号，阻止凋亡并维持增殖，预后差。TrkAIII缺失D4免疫球蛋白样胞外结构域，结合前高尔基体和线粒体膜，缺乏多个N-糖基化位点并错误折叠，触发未折叠蛋白反应。表达TrkAIII的细胞中Bcl-2上调，通过PI3K和Akt组成性信号传导，导致化疗耐药。阿霉素等氧化性治疗药物选择并强化TrkAIII的产生。
4.2.4 细胞成熟阶段异质性及由此产生的Trk和p75NTR表达和信号效应
神经嵴细胞迁移过程中转录组和表观遗传修饰持续变化，神经母细胞瘤细胞的分化状态可沿整个谱系变化。单个肿瘤内，由于微环境调节和化疗选择，存在转录和表观遗传不同的克隆区域。Trk和p75NTR的表达及其主要下游效应因子在单个患者肿瘤负荷内因克隆可塑性和异质性而变化。
4.3 克服神经母细胞瘤神经营养因子相关化疗耐药的挑战
4.3.1 诱导神经分化和增强TrkA和TrkC表达
含更多神经谱系分化细胞的神经母细胞瘤预后较好。治疗策略集中于诱导分化，最广泛研究的是使用维A酸受体激动剂配体。全反式维A酸（ATRA）和13-顺式维A酸（异维A酸）均被广泛研究。异维A酸因儿童耐受性更好而优先用于临床。证据表明，化疗消融和干细胞移植后异维A酸维持治疗可改善无事件生存率和缓解率。异维A酸维持治疗是晚期神经母细胞瘤患者的标准治疗。正在努力开发新型维A酸和制剂以改善药代动力学。
4.3.2 通过p75NTR信号诱导凋亡
芬维A胺被发现不诱导分化而是诱导凋亡，其细胞毒性不依赖CRABP1但依赖p75NTR表达和细胞内活性氧产生。p75NTR诱导的凋亡增强依赖p38MAPK和JNK磷酸化、caspase 3激活和Akt裂解。芬维A胺治疗导致MEK4和MEKK1上调及MEK3/6磷酸化。新型制剂包括免疫靶向纳米颗粒和脂质体制剂正在开发中。
5 神经母细胞瘤治疗耐药中发育相关的介质：SIX1和ATF5转录因子
5.1 SIX1和ATF5的发育表达与功能
SIX1在早期胚胎中广泛表达，在面部骨骼结构、耳基板和肾脏发育中发挥作用。EYA1-SIX1复合物作为转录因子，通过上调WNT抑制因子Frzb来抑制WNT信号。ATF5是bZip转录因子家族成员，在脑、骨、肝和脂肪细胞分化调控中发挥作用。在小鼠脑中，ATF5敲除导致脑室下神经祖细胞增殖大幅减少。在PC12细胞中，ATF5抑制 neurite 生长。ATF5是神经祖细胞中的促增殖、促存活蛋白，抑制分化和有丝分裂后状态。
5.2 SIX1和ATF5在神经母细胞瘤化疗耐药中的推定作用
SIX1在多种恶性肿瘤中表达，包括神经母细胞瘤。SIX1及其结合伙伴在维持干性、上皮-间质转化和肿瘤放化疗抵抗中发挥关键作用。在神经母细胞瘤中，EYA1被PRMT1甲基化激活后使SIX1去磷酸化并与之结合，MYCN是SIX1-EYA复合物的转录靶点。因此，MYCN过表达肿瘤也过表达PRMT1和Eya1。PRMT1对N-myc的甲基化延长其半衰期。ATF5在多种癌细胞中表达，在胶质瘤中高表达与间变性和化疗耐药相关。在神经母细胞瘤中，ATF5下调导致细胞凋亡，ATF5在MYCN过表达肿瘤中高表达。PRMT1敲除或抑制在MYCN过表达和非过表达神经母细胞瘤中均导致细胞死亡，该效应似乎通过PRMT1对ATF5基因H4R3me2a标记的调节实现。
5.3 克服神经母细胞瘤SIX1和ATF5相关化疗耐药的挑战
已尝试使用蛋白甲基化抑制剂。I型PRMT抑制剂在细胞系神经球和鼠模型中的临床前研究显示，抑制PRMT导致神经母细胞瘤细胞凋亡而非分化，表明抑制PRMT1对ATF5产生的影响是肿瘤抑制的主要机制。至少一种PRMT1抑制剂已在成人实体瘤I期临床试验中研究，但剂量限制性毒性（血栓栓塞事件）阻碍了疗效评估，且实体瘤递送和渗透似乎受限。
6 神经母细胞瘤治疗耐药中发育相关的介质：ALK酪氨酸受体激酶
6.1 ALK的发育作用
受体酪氨酸激酶在发育中发挥关键作用，包括间变性淋巴瘤激酶（ALK）和相关白细胞酪氨酸激酶（LTK）。在哺乳动物中，LTK在pre-B细胞、B细胞和脑中表达，而ALK在中枢和神经嵴来源的外周神经系统（包括交感神经节）中表达。ALK在发育过程中使已脱离细胞外基质的神经嵴细胞能够迁移，并防止这些细胞在间皮中迁移时凋亡。ALKAL配体家族已被识别，配体结合触发ALK二聚化和转自磷酸化激活，激活的ALK作为多种细胞内信号效应因子的支架，启动PI3K-Akt、JAK3/STAT3和Ras-ERK抗凋亡促存活通路。
6.2 ALK在神经母细胞瘤化疗耐药中的推定作用
ALK最初在间变性大细胞淋巴瘤细胞系中发现，该细胞系存在NPM-ALK融合蛋白。9-10.5%的原发神经母细胞瘤携带ALK基因突变，复发性神经母细胞瘤中ALK突变发生率接近20%。这些肿瘤特别侵袭性强且对常规化疗药物难治。在高危神经母细胞瘤患者中，ALK突变和扩增是预后不良的独立预测因子。获得性功能ALK突变使神经母细胞瘤化疗耐药。克唑替尼改善ALK突变复发性神经母细胞瘤的初始反应但未改变最终生存，原因包括药物诱导选择分泌β-catenin的神经母细胞瘤干细胞，β-catenin结合ALK并空间抑制克唑替尼结合，以及克唑替尼对ALK的亲和力因突变类型而异。第二代ALK抑制剂阿来替尼临床前研究有前景但未在患者中测试。第三代抑制剂劳拉替尼在儿童神经母细胞瘤中显示30%缓解率，其优于克唑替尼被认为与更强的细胞周期抑制有关。临床前研究表明，ALK在细胞表面密度较低且大部分ALK位于细胞内，这阻碍了CAR T细胞靶向ALK的方法。
6.3 克服神经母细胞瘤ALK相关化疗耐药的挑战
ALK抑制剂正在多项1-3期临床试验中研究。ALK相关化疗耐药涉及肿瘤利用发育重要分子和过程逃避ALK抑制，这些逃避机制有时创造可被利用的独特脆弱性。一项研究通过基因组分析发现，ALK抑制剂耐药细胞系发生NF1缺失，导致RAS-MAPK通路上调和ERK-RAF反馈下调，这些细胞对MEK抑制剂变得超敏感。另一项研究表明，BTK被异常ALK激活上调，ALK和BTK的联合抑制在异种移植模型中协同增强生长抑制。还可通过为每种常见致癌ALK突变制作突变定制诱饵配体或反义/siRNA来创建ALK抑制剂或抑制因子库。Bergaggio和Chiarle提出，先用高亲和力ALK抑制剂诱导ALK在细胞表面二聚化和聚集而不触发信号，再用靶向特定突变ALK的CAR T细胞可能有效。神经母细胞瘤细胞从神经内分泌或肾上腺素能表型向间充质或雪旺细胞样表型转变是ALK抑制剂耐药的另一机制，间充质细胞不表达ALK。诱导神经内分泌表型的预处理可能增强对ALK抑制的敏感性。使用CRISPR-Cas9技术将突变ALK编辑为野生型序列是未来的设想。
7 神经母细胞瘤治疗耐药中发育相关的介质：组蛋白去乙酰化酶和zeste同源物2增强子组蛋白修饰酶
7.1 HDAC和EZH2的发育激活与功能
HDAC酶家族和甲基转移酶EZH2在神经嵴细胞迁移过程中的转录调控中发挥核心作用。18种已知HDAC分为4类。I类HDAC主要在神经系统和颅面神经嵴衍生物中研究，参与EMT过程中的转录门控。IIa类HDAC具有N端磷酸化位点，磷酸化导致从细胞核转运至细胞质。IIb类HDAC主要在细胞质中。HDAC11是IV类唯一成员。EZH2是重要的组蛋白甲基转移酶，作为polycomb抑制复合物的一部分抑制基因表达。EZH2通过H3K27me3标记抑制Zic1、Pax3、Sox10、Ascl1、Phox2a和Phox2b等基因的表达，这些基因必须适当调控以维持肠神经系统神经嵴衍生物的正常神经和胶质分化平衡。
7.2 HDAC和EZH2在神经母细胞瘤化疗耐药中的推定作用
神经母细胞瘤细胞在面对HDAC治疗时可进行代谢重编程。MYCN过表达肿瘤利用Warburg效应。HDAC抑制剂治疗下调MYCN和糖酵解途径的两种限速酶，细胞通过将剩余糖酵解转向TCA循环并上调脂肪酸氧化酶来适应，维持ATP产生并逃避HDAC抑制效应。HDAC去乙酰化和EZH2等酶的甲基化使特定位点染色质关闭，下调凋亡相关基因及其通路转录。EZH2被认为是N-myc的靶点，通过甲基化推定肿瘤抑制基因的H3K27并影响β-catenin、Ras和NF-κB通路来支持致癌性和化疗耐药。EZH2还激活Src激酶。
7.3 克服神经母细胞瘤HDAC和EZH2相关化疗耐药的挑战
针对代谢旁路机制，mTORC1抑制剂西罗莫司可逆转细胞代谢重编程并产生协同细胞死亡。HDAC抑制剂与imipradone联合在神经母细胞瘤细胞系中显示协同疗效。HDAC8特异性抑制剂在临床前研究中特别有效。EZH2抑制在临床前研究中导致神经母细胞瘤活力、运动性、干性标志物和异种移植肿瘤生长降低。一种EZH2抑制剂因安全性问题（部分受试者出现继发性血液癌症）已从研究中撤回。
8 讨论
神经母细胞瘤是源自发育中神经嵴细胞的癌症，占儿童癌症的8%和儿童癌症死亡率的15%。低危患者5年无事件生存率超过90%，中危为85%，高危仅50%。难治性部分与瘤内和转移部位间的异质性及发育介导的分子、蛋白质组和细胞表型可塑性有关。肿瘤内存在不同分化阶段的细胞区域，从肾上腺素能神经内分泌细胞到雪旺样基质细胞，具有双向转变能力。神经营养因子受体配体、p75NTR合作结合及信号效应因子对环境的依赖性增加了复杂性。转录因子因下游活性多样性、缺乏有序结构、无底物结合位点及需要多种辅因子而成为挑战性靶点。化学库筛选发现一种化合物可降低N-myc细胞半衰期。抑制PRMT在动物模型中有效且无毒，但脱靶效应限制了剂量递增。EZH2抑制剂毒性不可耐受已被撤回。HDAC抑制剂正在儿童1期临床试验中。针对ALK家族性突变的抑制剂前景良好，未来可考虑CRISPR-Cas9编辑。
8.1 本综述的优势与局限性
本综述并非对所有神经母细胞瘤治疗方法的系统回顾，可能遗漏其他发育相关机制。但优势在于深入聚焦于说明发育可塑性和细胞及环境异质性 contributes to 神经母细胞瘤化疗耐药这一总体概念的实例。
9 结论
神经母细胞瘤是最常见的儿童癌症，起源于迁移形成交感神经系统的神经嵴细胞。肿瘤表达谱反映了神经嵴细胞在EMT过程中的发育可塑性及其赋予细胞的恶性和化疗耐药特性。克服化疗耐药的尝试包括针对神经营养信号、其他酪氨酸激酶功能获得性突变、发育相关转录因子及其靶点、以及组蛋白修饰酶的药物和辅助治疗。治疗面临挑战：正常发育与化疗耐药共享效应因子和机制使安全性难以保证；发育中交感神经母细胞表达谱、生理和形态谱系的可塑性允许逃避靶向化疗攻击。未来努力将利用更新的分子技术及其适应体内人类应用的潜力，并继续涉及个体化治疗和轮换及辅助治疗鸡尾酒方法，以应对神经母细胞瘤特征性的瘤内发育和致癌信号进化。
