《Frontiers in Genetics》：Identification of ion homeostasis-related genes as diagnostic biomarkers for pulmonary arterial hypertension via WGCNA and machine learning
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背景：肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种严重的心血管疾病，其早期诊断十分困难。离子稳态失衡参与PAH的发病过程，但涉及离子稳态相关基因（ion homeostasis-related genes，IHRG
背景：肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种严重的心血管疾病，其早期诊断十分困难。离子稳态失衡参与PAH的发病过程，但涉及离子稳态相关基因（ion homeostasis-related genes，IHRGs）的系统性调控网络及其诊断潜力仍不清楚。方法：本研究利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习方法识别PAH的潜在诊断生物标志物。将WGCNA应用于GSE117261数据集，以鉴定与PAH相关的IHRGs，随后通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行功能分析。采用三种机器学习算法——LASSO、SVM-RFE和Boruta——筛选核心基因，并在GSE117261和GSE113439数据集中进行验证。此外，生物信息学分析探索了这些基因在PAH免疫微环境及调控机制中的作用，并辅以体外低氧实验验证S1PR1和CA2对内皮细胞的保护效应。结果：WGCNA鉴定出55个富集于离子稳态和免疫通路的IHRGs。机器学习交叉验证筛选出9个核心基因，其中ABCG2、CA2和S1PR1显示出较强的诊断效能。体外实验进一步证实，低氧条件下CA2表达显著上调，而S1PR1表达下调。S1PR1过表达可有效抑制内皮细胞凋亡、减轻炎症反应并增强紧密连接蛋白表达，而CA2敲低则产生相反效应。结论：本研究确定了ABCG2、CA2和S1PR1作为PAH的潜在诊断生物标志物，提示IHRGs通过调节离子稳态和内皮功能参与疾病进展。其中，S1PR1表现出明确的内皮保护作用，而CA2可能参与低氧诱导的内皮适应过程，为PAH的机制研究和早期诊断提供了新的候选靶点。
### 论文解读：离子稳态相关基因作为肺动脉高压诊断生物标志物的系统筛选与功能验证
#### 一、研究背景与科学问题
肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种以肺血管阻力进行性升高和右心室后负荷增加为特征的恶性心血管疾病，最终可导致右心衰竭和死亡。其病理生理机制极为复杂，涉及肺血管内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞异常增殖与迁移、炎症免疫应答、代谢重编程以及细胞外基质重塑等多个环节。尽管靶向药物如内皮素受体拮抗剂、前列环素类似物和磷酸二酯酶-5抑制剂的应用改善了部分患者的预后，但PAH的早期诊断仍是重大临床挑战。目前诊断PAH的金标准仍依赖右心导管检查，这是一种有创操作，难以广泛用于早期筛查和动态监测；而超声心动图估测的肺动脉压和脑钠肽水平等无创指标在疾病早期敏感度和特异度不足。因此，探索高灵敏度、高特异度的新型分子诊断生物标志物具有重要临床意义。
在PAH发病与进展过程中，细胞内外的离子浓度动态平衡——即离子稳态——发挥基础性作用。钾、钙、钠、氯等离子通过相应的通道、转运体和泵在质膜上被精确调控，直接影响肺血管平滑肌细胞的膜电位、兴奋-收缩耦联、增殖和凋亡。已有研究证实TRPM7、ANO1等离子通道分子参与PAH的血管重塑，并具有临床诊断价值。然而，目前关于离子稳态相关基因（ion homeostasis-related genes，IHRGs）在PAH中的研究多聚焦于单个或少数分子，缺乏从系统生物学角度全面阐明IHRGs在PAH病理网络中协同作用模式的工作。同时，哪些IHRGs是疾病进展的核心驱动因子，是否具备转化为临床诊断生物标志物的潜力，仍是有待解答的科学问题。
#### 二、研究策略与技术方法
研究人员从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取PAH转录组数据，将GSE117261（58例PAH样本和25例正常对照）作为训练集，GSE113439（15例PAH样本和25例正常对照）作为独立验证集。IHRGs从Harmonizome数据库获取。主要技术方法包括：利用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）构建基因共表达网络，筛选与PAH临床特征显著相关的基因模块；通过基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析探索候选基因功能；采用三种机器学习算法——最小绝对收缩和选择算子（LASSO）、支持向量机-递归特征消除（Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination，SVM-RFE）和Boruta——交叉筛选核心诊断基因；利用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）和Spearman相关分析评估免疫浸润关联；通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）、NetworkAnalyst平台构建竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控网络，并利用GeneMANIA数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。体外实验采用人肺动脉大血管内皮细胞（Human Pulmonary Great Artery Endothelial Cells，HPAEC），建立1% O?低氧模型，通过过表达质粒和siRNA转染、定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot，WB）和流式细胞术验证S1PR1和CA2对内皮细胞凋亡、炎症及紧密连接蛋白表达的影响。
#### 三、主要研究结果
**3.1 基于WGCNA的PAH相关IHRG模块鉴定与功能分析**
研究人员对GSE117261数据集应用WGCNA算法，在满足无标度拓扑准则（R2 > 0.9，β = 6）条件下共鉴定出12个基因共表达模块。相关性分析显示，MEgreen、MEturquoise和MEpink模块与PAH显著正相关，其中MEgreen模块相关性最强（R = 0.79，P < 0.0001）。将这三个模块合并后与IHRG基因集取交集，获得55个候选基因。GO富集分析表明，候选基因显著富集于钙离子稳态调节、趋化性和单价离子跨膜转运等生物学过程；分子功能方面主要涉及趋化因子及其受体结合、G蛋白偶联受体结合和离子通道调节；细胞组分方面富集于细胞膜及其功能亚区（如膜筏、T-小管和刷状缘膜）以及多种跨膜转运复合体。KEGG富集分析显示，候选基因显著富集于趋化因子信号转导和细胞因子-细胞因子受体相互作用等免疫和炎症相关通路，提示这些基因可能参与免疫调节和内环境稳态维持。
**3.2 基于机器学习的PAH诊断生物标志物筛选**
研究人员采用三种机器学习算法系统分析55个候选基因。SVM-RFE筛选出12个关键基因，Boruta算法识别出27个与PAH显著相关的候选基因，LASSO回归在最优惩罚参数（λ = 0.01772027）下保留了16个非零系数特征基因。三种算法取交集后共获得9个核心诊断基因。进一步在两个独立验证数据集（GSE117261和GSE113439）中绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线并评估曲线下面积（area under the curve，AUC），只有ABCG2、CA2和S1PR1在两组数据集中均表现出相对稳定且稳健的诊断效能。在GSE117261中，ABCG2、CA2和S1PR1的AUC值分别为0.843、0.814和0.814；在GSE113439中，三者AUC值分别为0.636、0.673和0.924。这表明ABCG2、CA2和S1PR1具有作为PAH可靠鉴别诊断生物标志物的潜力。
**3.3 诊断基因调控网络与功能特征分析**
免疫相关性分析显示，S1PR1表达与浆细胞样树突状细胞（pDC）数量及II型干扰素应答显著正相关，与免疫检查点通路、肿瘤浸润淋巴细胞、CD8+ T细胞和T细胞共刺激显著负相关；ABCG2表达与CCR信号通路、炎症促进反应、多种免疫细胞（包括巨噬细胞和B细胞）浸润及免疫检查点分子负相关；CA2表达与副炎症反应显著负相关。调控网络预测揭示，S1PR1可能受PAX2、MEF2A和IRF4等转录因子调控，并与多种miRNA关联；ABCG2可能受MAX、JUN、USF1等转录因子及hsa-miR-328和hsa-miR-129等miRNA共同调节；CA2则可能涉及hsa-miR-618、hsa-miR-337-3P、hsa-miR-224等miRNA和NONO、E2F3、E2F2、FOS、ANKZF1等转录因子组成的复杂调控网络。基于GeneMANIA构建的PPI网络及功能富集分析表明，相关基因主要参与维持细胞物质交换和内环境稳态，涵盖跨膜转运、代谢物转运和生理稳态调节等关键生物学过程。
**3.4 S1PR1的GSVA富集分析**
研究人员基于S1PR1表达水平将PAH样本分为高表达组和低表达组，利用基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）进行通路富集分析。结果显示，S1PR1表达变化显著富集于紧密连接和黏附连接通路，提示S1PR1可能通过影响细胞连接相关通路参与肺血管内皮屏障功能和血管重塑的调节，进而在PAH发病中发挥作用。
**3.5 S1PR1和CA2在低氧条件下对内皮细胞生物学功能的影响**
体外低氧模型实验显示，低氧处理后内皮细胞中S1PR1表达显著下调（p < 0.0001）。在低氧条件下过表达S1PR1后，凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase 3表达显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著升高；流式细胞术证实S1PR1过表达显著减少低氧诱导的内皮细胞凋亡（p < 0.0001）；qRT-PCR结果显示S1PR1过表达下调促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达（p < 0.001），并显著上调紧密连接相关蛋白ZO-1和Claudin-5的表达。对CA2的研究显示，低氧显著上调CA2表达（P < 0.001），而敲低CA2产生与S1PR1过表达相反的效应，即促进内皮细胞凋亡、增强炎症反应并损害屏障功能。这些结果表明S1PR1和CA2可能从相反方向协同调节内皮稳态。
#### 四、讨论与结论总结
讨论部分指出，PAH的病理过程涉及血管收缩、原位血栓形成和血管壁重塑等多种机制。近年来，离子稳态失调被认为是驱动肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞功能障碍的关键因素，但其系统性调控网络和核心效应分子尚未完全阐明。本研究通过整合多组学分析、机器学习和体外功能验证，系统揭示了IHRGs在PAH中的诊断价值及潜在病理生理机制。
研究通过WGCNA鉴定了55个核心候选基因，功能富集分析显示这些基因主要参与钙离子稳态调节、趋化因子信号通路和跨膜转运等生物学过程，提示离子稳态失调与免疫炎症反应之间存在紧密的功能联系和协同作用。三种机器学习算法最终鉴定出9个核心诊断基因，其中ABCG2、CA2和S1PR1在两个独立数据集中均表现出良好诊断性能，验证了其作为PAH潜在生物标志物的可靠性和泛化能力。免疫特征分析揭示了这三个基因与PAH免疫微环境多个方面的显著关联，拓宽了对PAH作为“血管炎症性疾病”的认识。体外实验率先报道CA2在低氧条件下显著上调，而S1PR1下调；S1PR1过表达表现为内皮保护作用，CA2敲低则呈现相反趋势。
研究结论为：本研究通过生物信息学和分子生物学方法筛选出具有潜在诊断价值的核心IHRGs，并从免疫调节、分子网络和细胞功能等多个维度阐明了这些基因在PAH发病中的重要作用。以S1PR1、ABCG2和CA2为代表的IHRGs可作为PAH的潜在诊断生物标志物，通过调节离子稳态和免疫炎症反应最终影响内皮屏障功能、细胞存活和炎症状态。其中S1PR1表现出明确的内皮保护作用，CA2可能参与低氧诱导的内皮适应过程，为PAH的机制研究和早期诊断提供了新的候选靶点。
研究也存在局限性：诊断生物标志物仍需在前瞻性大规模临床队列中进一步验证；机器学习策略可能遗漏部分具有重要生物学功能但预测效能较弱的节点；ABCG2在PAH中的具体功能机制尚需深入探索；预测的转录因子和miRNA调控关系需要通过染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告基因等实验直接验证。
