《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Spatial proteomics: technical evolution and applications in cancer research
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空间蛋白质组学（Spatial Proteomics）正在通过将蛋白质表达与细胞身份、组织结构和临床行为相关联，重塑基于组织的癌症研究。传统蛋白质组学已为蛋白质鉴定和定量提供了有力工具，但大多数批量（bulk）工作流程抹除了定义肿瘤生态的空间关系。相比之下，空
空间蛋白质组学（Spatial Proteomics）正在通过将蛋白质表达与细胞身份、组织结构和临床行为相关联，重塑基于组织的癌症研究。传统蛋白质组学已为蛋白质鉴定和定量提供了有力工具，但大多数批量（bulk）工作流程抹除了定义肿瘤生态的空间关系。相比之下，空间蛋白质组学结合多重成像（multiplexed imaging）、基于质谱的组织分析（mass spectrometry-based tissue analysis）、区域选择剖析（region-selected profiling）和计算空间统计（computational spatial statistics），在天然组织背景下测量蛋白质。本综述总结了蛋白质组学从早期分离和质谱技术到当前空间平台的发展历程，并重点聚焦其在癌症中的应用，包括肿瘤异质性、肿瘤微环境、抗肿瘤免疫、免疫治疗反应、空间生物标志物和治疗耐药。在这些领域中，空间蛋白质组学最核心的价值在于将描述性组织模式转化为关于细胞状态、邻近互作和治疗脆弱性的可检验假说。该领域目前需要标准化工作流程、临床锚定队列和功能验证，以推动其从高维组织图谱走向稳健的转化工具。
一、引言：空间蛋白质组学的定义与价值
空间蛋白质组学通过在完整或空间配准的组织中测量蛋白质丰度、定位和细胞背景，解决了传统批量蛋白质组学丢失组织结构信息的问题。与空间转录组学相比，空间蛋白质组学更接近功能效应生物学，因为蛋白质直接执行信号转导、代谢和细胞间通讯；与常规免疫组织化学相比，其在同一组织切片上提供更高的多重检测能力和更定量的空间读数。在肿瘤学中，肿瘤是空间组织的生态系统，恶性克隆、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞和细胞外基质构成局部微环境。空间蛋白质测量能够显示细胞毒性T细胞是否进入肿瘤巢、巨噬细胞是否聚集在坏死区域附近、成纤维细胞是否形成排除免疫细胞的屏障，这些组织层面的关系是解释肿瘤异质性、免疫治疗反应和治疗诱导耐药的核心。
二、从蛋白质组学到空间蛋白质组学：简要发展轨迹
该部分追溯了从蛋白质分离到组织分辨蛋白图谱的演进过程。20世纪70年代，二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis）实现了蛋白质混合物的分离。20世纪80年代末至90年代初，电喷雾电离（electrospray ionization, ESI）使蛋白质分析转向肽段中心的工作流程。20世纪90年代至21世纪初，数据库搜索算法和肽质量指纹图谱实现了可扩展的蛋白鉴定。定量蛋白质组学阶段，ICAT（isotope-coded affinity tags）、SILAC（stable isotope labeling by amino acids in cell culture）和iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）相继引入，使蛋白质组适于比较生物学状态。2010年代，亚细胞和定位聚焦蛋白质组学开始恢复空间维度：APEX2邻近标记、LOPIT（localization of organelle proteins by isotope tagging）、Human Protein Atlas和SubCellBarCode使蛋白质位置成为核心生物学变量。2010年代末以来，激光捕获显微切割与自动化纳升液滴处理、自动化质谱成像、多重离子束成像等技术的融合催生了空间蛋白质组学。2020年代，分析单位已从批量裂解物转变为单细胞、亚细胞区域、组织学区室、肿瘤边界或多细胞生态位。
三、技术与计算分析
当前空间蛋白质组学平台可分为抗体成像、质谱成像和区域选择剖析三大类。基于抗体的平台包括多重离子束成像（multiplexed ion beam imaging, MIBI）、成像质谱流式（imaging mass cytometry, IMC）和多重免疫荧光，可提供单细胞空间分辨率的多种蛋白标记定量。循环抗体成像亚类包括CODEX/PhenoCycler和t-CyCIF，利用DNA条形码抗体或重复染色实现高重单细胞图谱。质谱成像方法如MALDI-MSI和空间LC-MS不依赖预设抗体，可发现非预期分子；二次离子质谱（SIMS/nanoSIMS）和DESI-MSI分别提供亚微米化学成像和环境表面采样。区域选择剖析平台如GeoMx DSP允许基于形态学或病理学选择感兴趣区域进行蛋白和转录本共剖析，现已支持约570种抗体（Immuno-Oncology Proteome Atlas, IPA）和超过1,200种蛋白靶标（Discovery Proteome Atlas, DPA）。基于测序的确定性条形码方法如DBiT-seq和spatial-CITE-seq可同时定位mRNA和抗体衍生蛋白标签。计算分析是数据转化为生物学洞察的关键环节，需要图像配准、细胞分割、细胞分型、批次校正、邻域分析和临床建模；Squidpy、SPIAT等工具支持空间统计，但分割误差、阈值选择、邻域尺度和过拟合均可影响生物学结论。可靠的空间蛋白质组学要求预先锁定分析流程、版本化可重复、阳性阴性对照、外部验证以及不确定性分析。
四、空间蛋白质组学的优势
空间蛋白质组学的主要价值不在于更高的多重检测能力，而是在保留的组织结构中解释蛋白质表达。批量蛋白质组学无法区分信号来源于恶性细胞、免疫浸润、成纤维细胞、内皮细胞还是罕见细胞生态位。空间蛋白质组学可将分子分析与肿瘤分级、侵袭前沿、坏死、免疫浸润、血管结构和基质区室对齐。该技术还提供可解释性优势，如“CD8阳性细胞被排除在肿瘤巢外”等空间特征易于临床和病理学专家理解。此外，人工智能虚拟空间蛋白质组学（如H&E-to-protein expression, HEX模型）有望从常规组织切片中推断蛋白图谱，但其预测值需经蛋白水平校准和外部验证，不能替代直接测量的空间蛋白质组学。需要注意的是，空间关联不等于因果关系，机制主张仍需要正交测量和扰动实验验证。
五、癌症研究中的应用
肿瘤异质性与区域肿瘤状态：空间蛋白质组学量化了肝细胞癌的肿瘤间和肿瘤内异质性，在胰腺癌中揭示了恶性和基质蛋白程序的区域差异，在结直肠腺瘤中通过深度视觉蛋白质组学（deep visual proteomics, DVP）对癌前病变进行分子分层，在弥漫性恶性间皮瘤中连接了组织学异质性和区域分子差异。区域异质性是最可重复的结论，而具体蛋白程序需在更大规模多区域队列中验证。
肿瘤微环境与基质组织：肝细胞癌空间蛋白质组学鉴定出与临床结局关联相反的基质结构和成纤维细胞亚群；泛癌CAF分析将成纤维细胞状态置于空间转录组和蛋白质组图谱中；脊索瘤中GeoMx DSP结合多组学将缺氧诱导的内质网应激CAF与GMFG-ITGB1信号和免疫重塑连接；高级别浆液性卵巢癌的多重成像显示了与BRCA1/2状态相关的免疫微环境特征；结直肠癌中空间蛋白质组学与单细胞分析共同揭示了CAF通过NECTIN2信号抑制效应T细胞的机制。基质组织的空间异质性具有多平台一致性，而具体信号轴仍需独立扰动验证。
肿瘤免疫与免疫治疗反应：原发黑色素瘤的单细胞多重成像表明了淋巴细胞浸润模式的功能异质性；转移性黑色素瘤接受肿瘤浸润淋巴细胞过继治疗的空间蛋白质组分析显示，治疗反应与预先存在的CD8阳性T细胞-髓系细胞网络相关；晚期非小细胞肺癌中空间多组学研究开发了预测免疫治疗结局的空间特征；肌层浸润性膀胱癌中肿瘤微环境空间关系与新辅助化免治疗的病理反应相关；头颈癌中三级淋巴样聚集体动力学与免疫治疗反应相关。治疗锚定的免疫研究提供了最清晰的转化证据，但尚无通用的空间免疫分类器。
诊断、预后与空间生物标志物：三阴性乳腺癌中数字空间剖析鉴定了与辅助治疗反应相关的预后特征；结肠肿瘤转移的数字空间剖析获得了转移相关空间蛋白特征；头颈鳞癌的单细胞空间蛋白质组学将肿瘤-免疫空间结构与临床结局关联；前列腺癌中空间蛋白质组学解释了多参数MRI不可见肿瘤的分子和组织学基础；质谱成像在肾透明细胞癌和甲状腺乳头状癌中鉴定候选生物标志物。细胞生态位（cellular niches）作为空间生物标志物具有生物学背景优势，但依赖分割质量、邻域定义和队列特异性截断，需与三级淋巴结构等特征在同一队列中进行比较验证。
治疗靶点、药物反应与耐药：头颈癌的深层空间组学提供了替代治疗靶点和治疗失败的机制依据；HER2阳性乳腺癌新辅助治疗期间的纵向空间蛋白质组学将空间蛋白特征与病理反应关联；基于大规模空间蛋白质组特征的反事实学习框架提出了可增加T细胞浸润的预测性扰动。纵向治疗相关组织研究更接近临床验证，而计算预测仍需实验验证。
六、挑战与未来展望
主要挑战包括抗体特异性、组织处理、分割质量、批次效应和数据解释。标准化是当前最迫切的需求，应遵循MITI（Minimum Information for Highly Multiplexed Tissue Images）指南和HTAN（Human Tumor Atlas Network）报告规范，系统报告预分析变量、平台采集元数据、抗体鉴定与验证、分割与分型规则、空间坐标与邻域定义、质量控制阈值和敏感性分析、患者水平统计模型等七个核心域。生物验证方面，空间图谱只能提示相互作用，需结合正交确认、共培养实验、类器官或离体组织模型、动物模型扰动和独立临床队列建立验证阶梯。未来发展方向是多组学整合——空间蛋白质组学与高深度LC-MS/MS、空间转录组学、单细胞测序、代谢组学和数字病理学相结合。
七、结论
空间蛋白质组学已将蛋白质组学从平均化分子目录转变为组织分辨的功能图谱。在肿瘤学中，其能够细化对肿瘤内异质性、肿瘤免疫组织、生物标志物分布和治疗相关组织状态的理解，成为分子谱分析、病理学和精准肿瘤学之间的重要桥梁。未来需超越更高的多重检测能力，强调标准化报告、互操作数据分析、临床注释样本和功能验证，以推动空间蛋白质组学成为解释肿瘤生态系统和连接组织组织与临床可操作癌症生物学的核心方法。
