《Journal of Materials Chemistry B》：Green light-triggered generation of peroxynitrite with fluorescent reporting exploiting doxorubicin as a photoredox catalystOpen Access
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过氧亚硝酸盐（ONOO?）因其作为优异氧化剂和亲核试剂的双重作用而在化学和生物学中占据主导地位。这使得ONOO?成为一种有效的细胞毒性剂，可被用作“非常规”治疗剂，为治疗多种疾病开辟了新途径。然而，ONOO
过氧亚硝酸盐（ONOO?）因其作为优异氧化剂和亲核试剂的双重作用而在化学和生物学中占据主导地位。这使得ONOO?成为一种有效的细胞毒性剂，可被用作“非常规”治疗剂，为治疗多种疾病开辟了新途径。然而，ONOO?缺乏细胞选择性，使其时空控制成为必需且极具挑战。本文报道了一种新的分子策略，以高生物相容性的绿光作为唯一激发光源，并在氨基-硝基苯并呋喃的亚硝基衍生物（NBF-NO）和生理浓度的谷胱甘肽（GSH）存在下，利用化疗药物阿霉素（DOX）作为光氧化还原催化剂，实现ONOO?的精确时空控制生成。研究人员证明，DOX经绿光激发后布居的激发三重态被GSH通过电子转移猝灭，产生DOX半醌自由基阴离子。在厌氧条件下，该物种被NBF-NO氧化回DOX，随之形成NBF-NO自由基阴离子，后者释放一氧化氮（NO）并转化为NBF，作为唯一稳定的光产物。另一方面，在有氧条件下，分子氧与NBF-NO竞争氧化半醌自由基阴离子，恢复DOX，并由此形成超氧阴离子（O2˙?），其通过与NO的已知扩散控制反应生成ONOO?。在两种情况下，高荧光光产物NBF均充当内部光学报告物，实现光催化反应的实时监测。该工作为绿光激活的ONOO?生成平台奠定了光化学基础，为正在进行的生物学和治疗学研究提供了机制依据。
过氧亚硝酸盐（ONOO
?）是一种重要的活性氮物种，由一氧化氮（NO）与超氧阴离子（O
2˙?）经扩散控制反应生成，速率常数约为7×10
9 M
?1 s
?1。ONOO
?在pH 7.4下半衰期为1.9 s，但在生物介质中因与脂质、DNA和蛋白质反应而降至20 ms以下。其作为强氧化剂和亲核剂的双重角色使其成为最强细胞毒性剂之一，并能通过硝化蛋白质酪氨酸残基抑制多药耐药（MDR）外排泵。因此，ONOO
?被视为“非常规”治疗剂，既可独立作为细胞毒性分子，又可增强传统化疗药物克服MDR的疗效。然而，ONOO
?缺乏细胞选择性，且NO和O
2˙?在生物介质中扩散半径有限、半衰期短，必须同时同地快速产生，这使时空可控的ONOO
?生成极具挑战。光可提供精确的时空分辨控制，已用于光动力和光热治疗等非侵入性策略。已有光控ONOO
?发生器需使用UVA光或双光子近红外激发，生物相容性或操作性受限。本研究旨在发展一种以高生物相容性绿光为唯一激发源、以化疗药物阿霉素（DOX）为光氧化还原催化剂的荧光报告型ONOO
?生成平台。
研究人员设计了DOX/NBF-NO/GSH三元体系：绿光激发DOX后，其激发三重态被生理浓度谷胱甘肽（GSH）还原为DOX半醌自由基阴离子（DOX
˙?）；在厌氧条件下，DOX
˙?被NBF-NO氧化回DOX，生成NBF-NO自由基阴离子，进而释放NO并转化为强荧光产物NBF；在有氧条件下，分子氧与NBF-NO竞争氧化DOX
˙?，同时生成O
2˙?，与NO快速结合产生ONOO
?。NBF作为内部光学报告物，可实时监测光催化进程。该策略首次以临床抗癌药物DOX作为绿光激活的光氧化还原催化剂，在厌氧/有氧条件下分别可控产生NO或ONOO
?，且DOX不被光降解，保留药理活性，为联合化疗与光控活性氮治疗奠定了基础。
研究采用的主要技术方法包括：纳秒时间分辨激光闪光光解（用于表征DOX三重态与DOX
˙?自由基）；稳态紫外-可见吸收和荧光光谱（用于监测光反应及荧光报告物生成）；高效液相色谱（HPLC，用于鉴定光产物）；电化学NO电极（用于直接检测NO释放）；二氢罗丹明123（DHR123）作为O
2˙?选择性探针；荧光素硼酸酯（Fl-B）作为ONOO
?高选择性探针。所有实验均在含2.5% DMSO的水溶液中进行，DOX浓度为5 μM，NBF-NO为50 μM，GSH为1 mM；ONOO
?检测使用100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4），并采用532 nm连续激光进行稳态光解。
### 合理设计（Rational design）
研究人员基于三个已有发现进行设计：其一，NBF-NO在蓝光激发下释放NO并生成荧光NBF，可作为光学NO报告物；其二，红光吸收光敏剂可通过三重态介导的光致电子转移催化NBF-NO释放NO，关键中间体是NBF-NO自由基阴离子；其三，DOX可被还原为DOX
˙?，随后被分子氧氧化回DOX并生成O
2˙?。由此提出以DOX为光氧化还原催化剂，用绿光激发DOX产生三重态，GSH作为电子供体形成DOX
˙?，进而同时触发O
2˙?与NO生成，最终形成ONOO
?，并以NBF为荧光报告物。
### 光谱与光化学表征（Spectroscopic and photochemical characterization）
吸收光谱显示，DOX/NBF-NO/GSH混合物在基态无相互作用，且DOX是唯一在532 nm处有吸收的组分，确保绿光选择性激发DOX。激光闪光光解实验观察到DOX三重态在GSH存在下衰减加快，并生成具有520 nm吸收特征的DOX
˙?；估算GSH对DOX三重态的猝灭常数为6×10
8 M
?1 s
?1，对应吉布斯自由能约?1.4 eV。利用DHR123探针在有氧条件下检测到O
2˙?生成，并排除了单线态氧机理。DOX在GSH存在下光稳定性显著提高，说明其参与了催化循环而非光降解。厌氧条件下照射DOX/NBF-NO/GSH，观察到NBF特征吸收（480 nm）和荧光（560 nm）增长，HPLC证实NBF是唯一稳定光产物，且DOX未发生明显降解；由于DOX浓度仅为NBF-NO的十分之一，证明DOX以光催化方式驱动NBF-NO转化。有氧条件下光反应速率降低，归因于分子氧与NBF-NO竞争消耗DOX
˙?。NO电极检测显示NO释放严格受绿光开关控制，DOX单独对照无信号。使用Fl-B探针，有氧照射10分钟即观察到荧光素生成，而N
2饱和（缺O
2˙?）、缺NBF-NO（缺NO）、缺GSH（缺催化启动）对照均几乎无荧光增强，确证ONOO
?生成。定量比较显示NO生成速率约1.8 nM s
?1，低于NBF生成速率约7.5 nM s
?1，差异归因于部分NO被O
2˙?快速消耗生成ONOO
?。无GSH时DOX发生明显光降解且NBF-NO转化很少，表明GSH是催化循环不可或缺的电子供体。
总结讨论：该平台所有组分具有生物相容性——NBF-NO与NBF已被证明可被多种细胞耐受，GSH是细胞内源性物质，其氧化产物为二硫化物，不引入外来毒性。DOX在光催化循环中不被化学修饰，保留完整药理活性，避免了共价修饰NO供体导致DOX亚细胞定位改变和治疗效果下降的问题。由于ONOO
?和NO均可抑制MDR外排泵，该策略有望将DOX的化疗作用与光生成的NO/ONOO
?多维生物功能相结合，构成绿光激活的联合治疗方案，尤其适用于DOX已在临床使用的场景。未来需借助药物递送策略将DOX与NBF-NO优先输送至靶组织，以扩大治疗窗口。
研究结论：研究者开发了一种新颖的分子策略，不仅代表了罕见的由可见光控制且具有荧光报告功能的ONOO
?生成范例，更是首次利用抗癌药物DOX作为绿光吸收的光氧化还原催化剂实现光调控ONOO
?产生。该工作为绿光激活的ONOO
?联合治疗平台提供了光化学基础，相关生物学研究正在进行中。
