用于镰状细胞贫血终端诊断的光学生物化学即时检测装置

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Opto-biochemical point-of-care device for last-mile sickle cell anemia diagnosis

　　

•开发了一种便携式双 LED 生化分析仪，用于采用 HPOS 检测法进行镰状细胞贫血（SCA）的即时诊断（POC）。
•LED 吸光度响应显示出高线性度（R2 > 0.99），与商业分光光度计相当。
•智能手机驱动的设备实现了 60 个样本/小时的处理量，并具备自动分类和云端连接功能。
•针对 HPLC 金标准进行的内部验证显示，在 83 个样本中的分类准确率为 98.8%。

引言
镰状细胞病（SCD）是一种由β-珠蛋白基因中的单点突变引起的遗传性疾病，导致产生镰状细胞血红蛋白（HbS）。继承两份基因突变副本（纯合子）的个体患有 SCD，而仅继承一份突变副本（杂合子）的个体是携带者，这种情况被称为镰状细胞特征（SCT）。SCD 患者通常因红细胞镰变而遭受慢性溶血性贫血。这种贫血表现反映在镰状细胞贫血（SCA）这一统称中，它涵盖了 SCD 和 SCT，识别属于这两组的个体对于有效的筛查和遗传咨询计划至关重要。该疾病在撒哈拉以南非洲、地中海部分地区、印度和中东最为流行。SCA 患者通常产生大量比例的镰状细胞血红蛋白（HbS），它在低氧条件下聚合形成长链 [1]。聚合导致红细胞变硬并阻塞血管。镰状细胞患者的血管阻塞通常导致严重疼痛、器官损伤，在某些情况下导致中风 [2]。在医疗资源有限的国家，SCA 患者（尤其是儿童）的死亡率高达 40%（10 岁之前）[3]，幸存者的预期寿命为 53 岁 [4]。

目前没有一种针对这种遗传病的疗法既具有可扩展性又能为大多数受影响人群所负担。然而，早期诊断和管理可以显著改善患者的生活质量。此外，筛查计划结合遗传咨询对于防止下一代遗传该疾病至关重要 [5]。因此，筛查计划是全球努力减少疾病流行率并可能消除疾病的核心。

虽然高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳和基因测序能够实现准确的 SCA 诊断，但其高成本、复杂性和有限的便携性使其不适合大规模筛查计划 [6]。在资源有限的环境中，缺乏受过训练的技术人员以及静脉血样冷链运输的物流挑战阻碍了大规模筛查营地的实施。

另一方面，即时诊断（PoC）技术通过现场检测和即时结果提供了更实用的解决方案，消除了运输需求并减少了延迟。溶解度试验、侧向层析试验和基于纸的微芯片电泳等技术可作为 SCA 大规模筛查的 PoC 诊断解决方案。溶解度试验和侧向层析试验是定性测试，存在较高的假阳性和假阴性病例 [7]，阻碍了准确诊断和疾病根除努力。这些局限性主要归因于干扰性疾病状况（例如地中海贫血、严重贫血）、样本处理差异和对解释技能的依赖，以及温度和湿度等环境因素 [8]。基于纸的微芯片电泳平台与侧向层析试验和溶解度试验相比提供了更好的准确性。然而，样本制备涉及多个技能密集型步骤，且通量低（约每小时 6 个样本）[9]。

正在开发细胞成像 [10]、[11]、流式细胞术 [12] 和基于表面等离子体共振的 [13] 筛查技术，用于 SCA 的 PoC 筛查。然而，依赖笨重的仪器、劳动密集型的样本制备步骤以及无法预测疾病严重程度，使其不适合用于大规模筛查 [7]。使用适配体 [14] 和 CRISPR-dCas9 [15] 的电化学生物传感器正在开发中，分别用于检测 SCA 的特异性蛋白和基因突变。然而，这些方法目前受到复杂样本制备要求、冷链储存需求以及对复杂实验室工作流程的依赖的限制，尚不适合 PoC 应用。与此同时，正在探索缺氧控制的微流控生物传感器 [16]、[17]、[18] 来表征细胞对低氧条件的反应，这是疾病的一个关键物理标志。虽然这些技术提供了无标记和实时的细胞镰变监测，但其实用实施受到对笨重、不可 portable 的实验室设备、复杂气体控制系统和多步骤样本制备的依赖阻碍。此外，正在开发测量红细胞刚性的电液生物传感器 [19] 用于高通量筛查。然而，这些方法也受限于劳动密集型的样本制备，以及目前无法可靠识别 SCT 携带者，使其不适合在即时诊断点进行大规模人群筛查。因此，在资源有限、负担沉重的环境中，需要一种简单、准确且稳健的 PoC 诊断设备，能够可靠地区分正常、SCT 和 SCD 样本，这一需求已得到广泛认可 [20]。

最近开发的光学吸光度光谱技术，高性能光学光谱（HPOS），是一种有前景的 SCA 诊断技术。HPOS 缓冲液含有皂苷洗涤剂，可裂解红细胞并将血红蛋白释放到溶液中，还原剂焦亚硫酸钠对样本脱氧并触发 HbS 聚合。产生的脱氧 HbS 聚合物在高磷酸盐缓冲环境中的溶解度降低并部分沉淀，而 HbA 和其他变异体保持溶解状态。HbS 的这种选择性沉淀使 Soret 带吸光度（427 nm）与 HbS 比例成比例地降低，而主要由可溶性血红蛋白组分主导的 Q 带吸光度（555 nm）在基线校正后受散射影响极小，保持相对稳定 [21]。因此，Q 带与 Soret 带吸光度的比值随着 HbS 含量的增加而增加，从而实现 SCA 分类。吸光度比指标独立于总血红蛋白浓度，因为 Soret 带吸光度同时取决于总血红蛋白浓度和 HbS 比例，而 Q 带吸光度仅取决于总血红蛋白浓度，因此其比值隔离了仅由 HbS 产生的贡献。测试仅需 5 μL 全血，可通过简单的指尖刺破采集。样本与 1 mL 试剂混合后需在室温下孵育 15 分钟，并使用商业分光光度计进行吸光度读数。虽然 HPOS 技术与传统实验室技术（如 HPLC）相比要简单得多，但对实验室级分光光度计的需求阻碍了其广泛采用，因为目前可用的商业分光光度计由于成本高且占地面积大，不适合野外部署。

在两个特征波长（427 nm 和 555 nm）处准确测量光学吸光度代表了便携式 HPOS 兼容分析仪的基本设计要求。对于具有有限数量宽且非重叠吸收峰特征光谱的样本，基于 LED 的吸光度测量设备提供了一种具有成本效益的解决方案，通过利用样本吸收特性与适当选择的 LED 发射光谱之间的光谱兼容性来实现。几个研究小组开发了基于 LED 的吸光度测量系统，包括监测水中环境污染物的设备 [22]、测定尿液中铜水平的设备 [23]、量化尿液中酮体和葡萄糖的设备 [24]，以及基于反射的比色法 [25]。然而，这些系统均不符合 HPOS 兼容即时 SCA 诊断的具体性能和可用性要求。

为满足简单、可靠且具有成本效益的诊断模式需求，开发了一种专门兼容 HPOS 生化检测法的光电子生化分析仪。这种新型双 LED 生化分析仪，下文简称 HPOS 设备，由现成的电子元件设计而成，旨在作为商业分光光度计的便携式和经济型替代品。通过分析两个 LED 记录到的吸光度及其相应比值，设备自动确定给定血液样本的 SCA 状态。该设备经过校准，其性能针对 HPLC 金标准进行了验证，并在实地试验中与商业分光光度计进行了直接比较，证明了两种环境下具有相当进行分类准确率。这项工作突出了如何使专门定制的微型化系统有效地将强大的实验室技术转化为实用且可扩展的即时诊断解决方案，从而释放其在大规模 SCA 筛查中的全部潜力。

章节摘录
光电架构
HPOS 检测法依赖于血红蛋白在 427 nm 和 555 nm 处的特征吸收峰来诊断镰状细胞贫血。选择了蓝色（L1CU-VLT1000000000, Lumileds）和绿色（KP CSLPM1.F1-7P5Q-A-0, ams OSRAM）表面贴装 LED，因其寿命长且能在广泛的功率水平范围内驱动，确保持续可靠运行。所选 LED 的发射特性与脱氧血红蛋白的吸收峰紧密匹配。精确的 LED 强度控制是……

染料的线性评估
利用决定系数（R2）量化的吸光度与浓度之间的关系，对于酒石黄，分光光度计（427 nm 吸光度）为 0.9994，HPOS 设备（蓝色 LED 吸光度）为 0.9995（图 3a）。同样，对于 KMnO?，分光光度计（555 nm 吸光度）的 R2 值为 0.9971，HPOS 设备（绿色 LED 吸光度）为 0.9987（图 3b）。这些结果表明该设备表现出高度的线性……

结论
HPOS 检测法利用了脱氧 HbS 聚合物在高磷酸盐缓冲液中的选择性沉淀，这使得 Soret 带吸光度（427 nm）与 HbS 比例成比例地降低，而 Q 带吸光度（555 nm）保持相对稳定 [21]。因此，这两个吸光度的比值作为 HbS 含量的定量、血红蛋白浓度无关指标，能够区分正常、SCT 和 SCD 样本。双 LED 生化分析仪证明了……

资助
本工作部分由 Infosys Foundation Aarohan 社会创新奖（2023）资助，以及授予 Prof. Sai Siva Gorthi 的 Gore Subraya Bhat 数字健康讲席（2021?2023）。

生成式人工智能和人工智能辅助技术声明
在本工作准备过程中，作者使用了 Claude (Anthropic) 协助手稿编辑。作者审查并编辑了输出内容，并对发表文章的内容承担全部责任。

利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Biplab Nath、Neelam Verma、Sruthi Kunkuma Balasubramanian、Rajesh Srinivasan、Veerendra Kalyan Jagannadh、Sai Siva Gorthi 拥有一项归属印度科学理工学院（Indian Institute of Science）的待决专利，专利号为#Methods to Determine the Presence and Amount of Sickle Haemoglobin, Devices and Kits Thereof（印度专利申请号 202441105232），即“确定镰状细胞血红蛋白存在和数量的方法、设备及试剂盒”。如果有其他作者，他们声明他们……

致谢
作者感谢 Mr. Sujith Vijayan (Shanmukha Innovations Pvt. Ltd.) 对设备机械设计的贡献；以及 Mr. Pritimay Sarkar 和 Mr. Mohamed Kaif (Shanmukha Innovations Pvt. Ltd.) 对 Android 应用开发的贡献。

Biplab Nath|Neelam Verma|Sruthi Kunkuma Balasubramanian|Rajesh Srinivasan|Veerendra Kalyan Jagannadh|Sai Siva Gorthi