基于生理pH定量成像的调谐交联网络比例MRI探针

《Small》：A Ratiometric MRI Probe With a Tuned Crosslinked Network for Quantitative Imaging of Physiological pH

　　

定量pH成像对于理解病理组织环境和诊断肿瘤及炎症等疾病具有重要意义。基于MRI的pH定量方法已通过多种途径发展，包括化学交换饱和转移（chemical exchange saturation transfer, CEST）和比例探针策略。然而，现有方法在灵敏度、探针复杂性和可逆性之间存在权衡，稳健的定量pH成像仍具挑战性。研究人员先前报道了基于简单核壳结构的比例MRI探针，其中钆负载核心和pH响应水凝胶壳分别独立贡献纵向弛豫率（r₁）和横向弛豫率（r₂）。这些探针通过r₂/r₁比例实现了pH定量，但其pH响应未针对生理pH范围进行优化，且可用探针浓度范围受限。在本研究中，研究人员使用四乙二醇二甲基丙烯酸酯对壳层交联网络进行优化，在生理pH附近实现了r₂显著且依赖pH的变化，同时保持r₁不变并扩展了可用探针浓度范围。电子显微镜证实了该探针的核壳结构和元素分布。所得探针在0.5–1.5 wt.%的探针浓度范围内，实现了pH 6.0–7.5范围内的定量pH成像。这些发现为基于MRI的pH定量建立了一种实用策略，向标准化无创pH测量迈出了一步。

**基于调谐交联网络的比例MRI探针实现生理pH定量成像**

**1. 研究背景与科学问题**

活体组织中的pH测量对于理解病理微环境和疾病诊断至关重要。肿瘤和炎症组织常因代谢改变（包括癌细胞中的Warburg效应和免疫细胞中的糖酵解增强）而表现细胞外酸化。因此，开发能够无创可视化pH波动的成像技术具有重大需求。磁共振成像（MRI）凭借其深层组织可视化能力和高空间分辨率，成为无创pH成像的理想平台。

自20世纪90年代末以来，研究人员已开发多种基于Gd³⁺配合物的pH响应MRI造影剂，通过pH依赖性质子交换速率或Gd³⁺中心水合数的变化调节纵向弛豫率（r₁）。后续探针设计进一步利用分子翻滚、聚集或聚合物构象的pH依赖性变化来调节r₁或横向弛豫率（r₂）。然而，基于弛豫的探针在定量pH成像中面临核心挑战：观测到的弛豫速率同时依赖于pH响应性弛豫率调制和探针浓度，二者难以解耦。化学交换饱和转移（CEST）成像通过Z谱峰强度比作为浓度归一化读数，实现了浓度无关的pH测量，但该方法通常需要精确校正射频场不均匀性并依赖良好的磁场匀场条件。

作为另一种浓度归一化策略，弛豫基比例MRI探针通过纵向和横向弛豫速率的比值来消除探针浓度的影响。由于探针浓度[P]在比例中相互抵消，r₂/r₁可充当浓度归一化的pH定量参数。已有多种r₂/r₁比例MRI探针被开发，包括Mn-卟啉/氧化铁纳米颗粒组装体和DNA支架Gd³⁺配合物，实现了高pH分辨率的浓度无关定量。然而，这些探针在可逆性、组分比例维持和探针复杂度方面仍存在权衡。

为提供简化的探针架构，研究人员先前报道了基于核壳结构的比例MRI探针，由含顺磁性Gd³⁺配合物的pH不敏感二氧化硅纳米颗粒（SNP）核心和pH响应性聚（甲基丙烯酸-co-亚甲基双丙烯酰胺）壳层组成。该设计中，聚合物壳层的pH依赖性收缩可改变局部聚合物-水环境，提供pH响应性r₂；而固定在核心上的Gd³⁺配合物对此pH响应不敏感，提供稳定的r₁。尽管这一设计在4.0–7.0的宽pH范围内实现了基于r₂/r₁的pH成像，但在狭窄的生理pH窗口内需要更大的r₂/r₁变化才能实现体内pH定量。针对这一局限，本研究通过使用四乙二醇二甲基丙烯酸酯交联剂调控聚合物壳层网络，开发了适用于生理pH范围定量成像的比例MRI探针。

**2. 关键技术与方法**

研究人员采用微乳液法合成顺磁性SNP核心，并依据已报道方法用Gd³⁺配合物基硅烷偶联剂和甲基丙烯酸酯基团进行功能化。随后通过沉淀聚合法，分别以二乙二醇二甲基丙烯酸酯或四乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，在SNP核心表面包覆聚（甲基丙烯酸）壳层。研究系统评估了不同交联剂种类和配比对探针pH响应行为的影响。探针的结构表征采用扫描透射电子显微镜-能量色散X射线光谱（STEM-EDS）、透射电子显微镜（TEM）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。Gd含量通过电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）测定。pH响应行为通过动态光散射（DLS）和¹H-NMR弛豫时间测量（1 T和9.4 T）系统评估。MRI定量成像实验在1 T扫描仪上进行，涵盖pH 6.0–7.5范围和0.50–1.50 wt.%探针浓度范围。生物相关性验证在含10%胎牛血清（FBS）的缓冲液中进行。

**3. 研究结果**

**3.1 交联聚合物网络的优化**

研究人员首先测试了不同二乙二醇二甲基丙烯酸酯含量的探针。结果显示，最高交联剂含量（甲基丙烯酸/二乙二醇二甲基丙烯酸酯=50/50）的探针在pH 6.0–7.5出现聚集，r₂/r₁仅随pH降低轻微下降。较低交联剂含量（60/40和70/30）的探针虽表现出一定的pH依赖性r₂/r₁变化，但响应幅度较小，且在pH约6时发生聚集。这些结果说明针对游离微凝胶优化的交联条件无法直接移植到核壳探针的聚合物壳层。基于此，研究人员假设延长乙二醇间隔基长度可改变聚合物网络的柔韧性和水合状态，进而改善核壳架构中的pH响应行为，因此选用四乙二醇二甲基丙烯酸酯作为替代交联剂（40 mol%）。

DLS测量显示，随pH从8.0降至6.0，水合半径逐渐减小；在pH≤5.5的酸性条件下形成超过1 μm的聚集体。pH 6.0–7.5范围内DLS相关图和粒径分布未显示聚集证据，表明该pH范围内水合半径的渐进变化主要反映聚合物壳层的溶胀与收缩。弛豫测量显示，T₁几乎不随pH变化，而T₂随pH降低而减小，且pH依赖性T₂变化幅度在四批独立制备样品间具有充分可重复性。在9.4 T下，pH依赖性横向弛豫响应得以维持，而纵向弛豫速率接近溶剂值且无显著pH依赖性。这表明较长的乙二醇间隔基可能提供了适合在生理pH附近实现显著r₂响应的聚合物网络，同时保持r₁不变。

**3.2 结构表征**

STEM-EDS元素图谱显示Si和O信号集中在颗粒中心，与STEM图像一致。C信号主要分布在外围区域，尽管碳支持膜产生较强背景信号。经高斯滤波处理后，Gd信号在二氧化硅核心表面附近呈局部分布。Si和C的叠加图像清楚显示Si集中于核心而C分布在外围壳层，证实了二氧化硅核心-聚合物壳层架构且Gd位于核心表面。TEM图像显示直径约70 nm的球形纳米颗粒，进一步确认核壳纳米结构。FT-IR检测到sp³ C─H伸缩（3000–2700 cm^-1）和羰基C═O伸缩（1800–1600 cm^-1）振动，确认探针中的聚合物组分，四批独立合成样品的FT-IR光谱完全一致，支持合成方法的可重复性。ICP-OES测定Gd含量为0.038 wt.%，相应摩尔r₁为10 mM^-1 s^-1，约为Gd(DTPA)（3.9 mM^-1 s^-1）的2.6倍。通过缓冲液交换进行重复pH变化实验，探针在pH 6.0–8.0范围内表现出可逆的水合半径变化，确认了聚合物壳层的可逆溶胀-收缩行为。

**3.3 r₂/r₁比例定量pH成像**

基于方程（3）计算的r₂/r₁值在0.50–1.50 wt.%浓度范围内与pH呈浓度无关的相关性，可在pH 6.0–7.5范围内区分不同pH值，比先前探针更接近生理条件。1 T MRI扫描仪的r₂/r₁比例成像在0.50–1.50 wt.%浓度范围内清晰区分pH 6.0、6.5、7.0和7.5。与先前探针（可测量pH范围4–7，r₂/r₁变化幅度小于1）相比，本探针在pH 6.0–7.5的更生理相关范围内表现出显著增强的响应，r₂/r₁变化约3个单位。

在含10% FBS的缓冲液中验证时，虽然绝对值和pH 6.5–7.5间的动态范围较缓冲液条件有所降低，但两种pH条件在0.5–1.5 wt.%探针浓度范围内均可清晰区分。探针在pH 7.4储存一周后r₂/r₁比值维持在初始值的93%以上，支持其稳定性。

**3.4 Gd³⁺负载对r₂/r₁比例的影响**

由于顺磁性金属离子的r₁随磁场强度增加而降低，1/T_1,d在更高磁场中的贡献变得更加显著。研究人员合成了不同Gd³⁺负载量的探针，在固定纳米颗粒浓度（1.0 wt.%）下进行弛豫测量。结果显示1/T₁随Gd³⁺负载量增加呈线性增加，且在所有Gd³⁺负载量下T₁均不随pH变化。然而，r₂/r₁比例的动态范围随Gd³⁺负载量增加而减小，这是由于r₁升高所致。这表明最佳r₁值取决于成像时间和磁场强度。

**4. 讨论与结论**

本研究开发的基于顺磁性核壳纳米颗粒的比例MRI探针能够独立于探针浓度区分生理pH范围。与先前比例探针难以在6.0–7.5生理pH范围内实现高对比度pH定量的局限相比，本研究使用1 T MRI扫描仪实现了在该范围内区分0.5 pH差异的定量pH成像。

研究结论指出，通过进一步优化不同磁场强度下的钆配合物负载容量，结合核心和壳层的功能化修饰以及药物递送能力，可实现诊疗一体化。聚合物壳层中的羧酸基团允许引入肿瘤靶向配体（如RGD肽或叶酸），有望实现体内肿瘤选择性蓄积。由于本研究的比例方法与CEST具有不同的特征和机制，两种技术可作为定量pH成像方法互为补充，有望推动体内pH定量标准的建立和肿瘤诊断方法的发展。该研究发表于《Small》期刊。