基于微凝胶的化学限定平台实现iPSC自组装扩增及多尺度类器官分化

《Advanced Materials》：Microgels Enable iPSCs to Assemble, Expand, and Differentiate Into Organoids—From Sizable to High-Throughput

　　

类器官研究在个性化医疗和药物开发领域具有巨大潜力。然而，当前存在的局限性包括重现性问题，这主要源于生物源性材料的使用，其易受批次间差异影响。本研究报道了一种基于化学限定微凝胶（microgel）的方法，用于人诱导多能干细胞（iPSC）类器官的生成，能够在同一构建体内实现iPSC的扩增及后续分化，并适用于不同尺度，包括与自动化384孔板工作流程的兼容性。化学限定的聚乙二醇（PEG）基微凝胶通过并行化台阶乳化微流控技术（step-emulsification microfluidics）生产，可实现规模化制备。该方法利用iPSC与微凝胶的自组织构建三维结构，通过玻璃粘连蛋白（vitronectin）包被的PEG微凝胶实现稳健的细胞-材料相互作用。该技术允许iPSC扩增并保持多能性，随后可分化为三个胚层，为类器官分化提供了适宜平台。研究进一步将其拓展至心脏类器官和视网膜光感受器细胞的分化，以展示两个代表性组织。

研究背景与问题

类器官是三维体外器官模型系统，在疾病建模及下一代药物筛选与开发中日益受到关注。由于类器官来源于多能干细胞或器官特异性祖细胞，目前已开发出涵盖肝脏、心脏、大脑和视网膜等多种器官的类器官模型。诱导多能干细胞（iPSC）是通过特定转录因子强制表达将体细胞重编程至多能状态的细胞，具有自我更新和分化为所有胚层的能力，相较于胚胎干细胞（ESC）提供了更符合伦理且更易获取的替代方案，在个性化医疗和类器官研究中具有巨大潜力。

尽管细胞类型不断进步，类器官研究也通过引入多种生物材料作为支架以增强细胞组织化、稳定性和均一性。模拟细胞外基质（ECM）的水凝胶，如Matrigel、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸（HA）或脱细胞组织，是类器官研究中的主要生物材料。然而，这些生物源性材料持续表现出较高的批次间变异性，并可能具有致瘤潜力，因此亟需化学定义明确的生物材料系统。聚乙二醇（PEG）是最常用的合成水凝胶之一。

三维组织模型面临的主要挑战之一是培养致密的功能性组织，因为许多成熟细胞增殖减少且扩散不足。另一方面，iPSC具有高扩增潜力，但在三维水凝胶内部由于材料提供的多种信号高度影响细胞过程，会以不受控的方式开始分化。因此，需要一种三维水凝胶系统，允许iPSC扩增为致密细胞构建体，并在同一构建体中实现顺序受控分化。近年来，微孔退火颗粒（MAP）支架通过提供更多空隙空间增强细胞生长和浸润。MAP支架是由微凝胶组装的三维构建体，与传统纳米孔水凝胶相比具有微米级孔隙互连性。为以高生产率生产单分散球形微滴和微凝胶，并行化微流控台阶乳化已成为合适的方法。

研究内容与结论

研究人员开发了一种基于化学限定微凝胶的方法，用于iPSC类器官生成，能够在同一构建体内实现iPSC扩增及后续分化，适用于不同尺度，包括与自动化384孔板工作流程的兼容性。该方法利用iPSC与微凝胶的自组织构建三维结构，通过玻璃粘连蛋白包被的PEG微凝胶实现稳健的细胞-材料相互作用。该技术允许iPSC扩增并保持多能性，随后可分化为三个胚层。研究进一步将其拓展至心脏类器官和视网膜光感受器细胞的分化，以展示两个代表性组织。该研究发表于《Advanced Materials》。

关键技术方法

研究人员采用了以下主要关键技术方法：并行化台阶乳化微流控技术用于大规模生产单分散球形PEG微凝胶；光引发自由基聚合实现微凝胶的流内交联；胺-环氧偶联进行玻璃粘连蛋白功能化修饰；纳米压痕技术测定微凝胶力学性能；免疫荧光染色、RT-qPCR和基于DNA甲基化的PluripotencyScreen技术用于多能性和分化潜能的表征；活/死染色评估细胞活力；共聚焦显微镜成像；以及用于高通量自动化生产的液体处理系统。此外，研究人员使用了两种iPSC细胞系（UKAi009-A和UKAi0011-A）。

研究结果

1.1 大规模微流控生产和球形PEG基微凝胶的生物功能化

研究人员开发了并行化台阶乳化微流控装置，以约80 μm的平均直径和10⁷滴/小时的产率生成微滴。通过在微凝胶前体溶液中补充甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）引入环氧基团，实现玻璃粘连蛋白（VTN）的特异性结合。荧光胺标记和共聚焦成像证实了GMA的掺入和VTN的功能化。纳米压痕测量显示，所有测试条件下微凝胶的平均刚度范围低于50 kPa，处于体内特定组织（如心肌）的相关刚度范围内。

1.2 微凝胶实现毫米级iPSC扩增和分化支架

iPSC仅在VTN功能化的微凝胶上良好粘附，证实了GMA掺入和VTN功能化的必要性。通过OCT4染色确认了iPSC多能性的保持。研究人员优化了iPSC-微凝胶比例（约400 000细胞/4332微凝胶，约92细胞/微凝胶），实现了尺寸和形状一致的支架的可重现生成。培养48小时后观察到平均细胞活力为75.92% ± 15.21%。支架在21天培养期间保持机械稳定性和均匀球形形态，持续生长至面积11.47 ± 0.97 mm2和直径3.34 ± 0.13 mm，展示了系统的iPSC扩增能力。代谢活性测定支持了多个支架之间的重现性。氧扩散模拟表明微凝胶的存在可能增加支架内的氧可用性。

1.3 微凝胶-iPSC支架的定向分化

通过诱导向三个胚层分化，研究人员分析了iPSC在支架中是否保持分化潜能。胚层特异性标志物（内胚层：GATA4；外胚层：PAX6；中胚层：Brachyury）的免疫染色显示定向分化后各标志物的表达。PluripotencyScreen技术分析显示，未分化支架中iPSC保持相对较高的多能性评分，三种谱系分化分别引发了朝向中胚层、外胚层和内胚层的表观遗传修饰。RT-qPCR分析进一步支持了这些发现，证明了iPSC组装微凝胶形成毫米级构建体并扩增直至诱导受控分化的潜力。

心脏类器官分化

在微凝胶构建体内48小时扩增后启动心脏分化方案。支架在23天心脏分化期间表现出机械稳定性和形状一致性。心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达分布证实了整个毫米级类器官的成功分化。冷冻切片分析显示支架核心存在细胞核和cTnT表达。RT-qPCR分析显示标志基因表达与二维对照培养相当，且从分化第16天到第26天观察到MHC-alpha和NKX2.5表达下降伴随cTnT表达增加，提示心肌细胞开始成熟。心脏类器官通过持续均匀搏动证明其功能性和整个支架内互连网络的形成。钙成像显示不同感兴趣区域（ROI）的搏动频率一致，验证了心肌细胞互连性不受微凝胶阻碍。氧传输模拟表明，添加约1280个微凝胶理论上可避免坏死核心和缺氧区域的形成。

1.4 支架生产缩小至96孔格式及心脏类器官和视网膜光感受器细胞分化

研究人员将平台缩小至96孔格式，初始细胞数减少（100 000细胞）可通过U形96孔板中的重力沉降实现稳定支架形成，无需离心步骤。心脏分化通过cTnT免疫荧光染色确认，整个支架均匀搏动。cTnT纤维直接邻近微凝胶排列并产生特征性横纹，表明微凝胶支持功能性互连cTnT网络的形成。视网膜分化方面，研究人员将二维光感受器分化方案适应至三维系统。第10天观察到眼域转录因子PAX6和RAX表达显著增加，检测到视网膜祖细胞标志物VSX2和光感受器祖细胞标志物CRX。CRX表达在第10天首次观察到，早于文献报道的至少21天，可能归因于三维系统提供的更有利环境及微凝胶的生理刚度。恢复蛋白（recoverin）表达在25天过程中持续增加。

1.5 使用自动化液体处理系统高通量生产iPSC/微凝胶支架

研究人员在低体积（25 μL）平底384孔板中实现了自动化高通量生产。基于稳定性和形状，选择125细胞/微凝胶的比例（10 000 iPSC和80微凝胶）。24小时后观察到球形支架形成，48小时内稳定致密化，平均面积为0.19 ± 0.05 mm2。培养5天后面积持续增加至0.25 ± 0.03 mm2，表明高细胞密度支架中的iPSC扩增。OCT4免疫染色确认了多能性，DAPI和OCT4平均灰度值分析显示低标准偏差（分别为4.6%和7.4%），表明细胞数和多能性的可重现性。心脏分化30天后，观察到自发搏动的心脏类器官，cTnT均匀表达于整个支架。钙成像和高速度明场成像表征了自发收缩活性，培养20天后96%的类器官表现出可测量的搏动记录。

讨论与结论

在干细胞和类器官研究中，重现性和可扩展性方面的挑战依然存在，这阻碍了这些技术在药物开发和疾病建模中的可靠应用。研究人员开发的新技术结合了iPSC在同一构建体内的扩增和分化，促进了从可观尺度到高通量的类器官可重现制造。该方法完全化学限定，采用PEG基微凝胶（包被重组产生的玻璃粘连蛋白）作为基质材料，并使用无动物源成分培养基。平台的再现性由均匀的微凝胶生产、恒定的微凝胶产率、每个工作流程明确的细胞-微凝胶比例以及基于体积的校准曲线微凝胶数量测定所支持。在优化条件下，在毫米级、96孔和自动化384孔格式中均一致观察到支架形成。研究人员认为该技术可为推进化学限定的类器官和干细胞研究提供用户友好的基础，对组织工程和药理学具有重要影响。未来研究必须进一步针对特定组织类型调整这些材料，这需要干细胞研究人员和材料科学家之间的密切合作。该研究获得的见解可使类器官研究更接近减少或替代动物试验，同时提供基于人类的替代方案，以在未来改善和加速药物开发和个性化医疗。