泰国药用植物中SARS-CoV-2主蛋白酶抑制活性天然产物的发现：余甘子、三敛与火索麻的植物化学研究

《RSC Advances》：Discovery of bioactive compounds from Thai medicinal plants as potential SARS-CoV-2 main protease inhibitorsOpen Access

　　

专业术语翻译
泰国药用植物作为结构多样的次生代谢产物的重要来源，具有潜在的抗病毒相关性。本研究对三种泰国药用植物——余甘子（Phyllanthus emblica）、三敛（Averrhoa bilimbi）和火索麻（Helicteres isora）进行了植物化学研究，以鉴定对SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease, Mpro）具有抑制活性的天然产物。三种植物的粗甲醇（MeOH）提取物在100 μg mL^?1浓度下表现出中等程度的Mpro抑制作用，余甘子、三敛和火索麻的抑制率分别为61.7 ± 1.5%、56.9 ± 3.8%和53.3 ± 1.7%。通过生物活性导向的分离和重复色谱分离，研究人员分离得到24个化合物，包括来自余甘子的9个成分（P1–P9）、来自三敛的6个化合物（A1–A6）以及来自火索麻的9个化合物（H1–H9）。这些代谢物涵盖植物甾醇（phytosterols）、羽扇豆烷型三萜（lupane-type triterpenoids）及其酯类、木脂素（lignans）、酚酯（phenolic esters）、黄酮类（flavonoids）及相关含氧衍生物。其中，A1被鉴定为一个新酚苷，命名为demethoxybilimoside A；而stigmastane-3β,6α-diol 3-O-tetradecanoate（P1）被分离并表征为纯化合物。所有分离化合物均评估了SARS-CoV-2 Mpro抑制活性。化合物P1（stigmastane-3β,6α-diol 3-O-tetradecanoate）、羽扇豆醇（lupeol, P4）、山柰酚（kaempferol, A5）和槲皮素（quercetin, A6）表现出较高的表观抑制活性，抑制率分别为99.3 ± 2.0%、88.5 ± 0.9%、95.8 ± 1.0%和99.5 ± 1.1%。化合物P1的表观半数抑制浓度（IC₅₀）为86.5 ± 3.8 μM，随后被选用于分子对接分析。上述发现拓展了泰国余甘子、三敛和火索麻的植物化学知识，并鉴定出多个值得进一步生化评价的化合物。

论文解读文章

**研究背景与目的**

尽管COVID-19大流行的急性阶段已经过去，SARS-CoV-2仍在全球范围内传播，病毒持续演变和反复感染使COVID-19依然是重要的公共卫生问题，开发有效抗病毒药物仍有迫切需求。SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease, Mpro），又称3C样蛋白酶（3C-like protease, 3CLpro）或非结构蛋白5（non-structural protein 5, nsp5），在病毒多聚蛋白加工和复制中发挥关键作用，是最受认可的抗COVID-19药物靶点之一。尽管已有小分子Mpro抑制剂（如ensitrelvir）获批用于临床，但病毒变异株的出现、潜在的耐药相关突变以及现有抗病毒疗法的局限性，促使研究人员持续寻找具有新化学骨架的结构多样性Mpro抑制剂。天然产物因其化学多样性和立体化学复杂性，成为抗病毒先导化合物发现的重要来源。

泰国拥有丰富的药用植物资源和传统民族药理学知识。余甘子（Phyllanthus emblica）是著名的药食两用植物，传统用于治疗发热、咳嗽、哮喘、腹泻、咽喉痛、炎症、泌尿系统疾病、便秘、心血管疾病等多种疾病，其不同部位已报道含有酚类化合物、甾体、倍半萜苷、黄酮类、查尔酮类、三萜类和植物甾醇等多种代谢物。三敛（Averrhoa bilimbi）为多年生木本植物，传统用于治疗糖尿病、高血压、感染和炎症等疾病，此前研究从泰国 Uttaradit 省采集的三敛枝条中分离得到新化合物 bilimoside A 并证明了其一氧化氮抑制活性。火索麻（Helicteres isora）传统用于胃肠疾病、糖尿病、炎症、感染和肝脏相关疾病，已有研究报道其含有苯乙醇苷类、酚类、黄酮类、甾体、三萜类和生物碱等成分。尽管余甘子已被广泛研究，但针对泰国采集标本的研究相对有限；三敛的枝条虽有报道，但叶片化学成分研究较少；火索麻果实中的α-葡萄糖苷酶抑制成分已有研究。基于上述背景，研究人员设计了一项以COVID-19为导向的泰国药用植物植物化学研究，旨在从三敛叶片、余甘子茎皮和火索麻根部中鉴定次生代谢产物，并评估其作为SARS-CoV-2 Mpro抑制剂的潜力。

**研究内容与结论**

研究人员对三种泰国药用植物的粗甲醇提取物进行了SARS-CoV-2 Mpro抑制活性初筛。在100 μg mL^?1浓度下，余甘子粗提物抑制率最高（61.7 ± 1.5%），三敛（56.9 ± 3.8%）和火索麻（53.3 ± 1.7%）次之，均表现出中等抑制活性。进一步溶剂分配后，余甘子的正己烷–乙酸乙酯（n-hexane:EtOAc）萃取物（51.5 ± 2.2%）、三敛的乙酸乙酯（EtOAc）萃取物（71.2 ± 4.4%）和火索麻的EtOAc萃取物（48.8 ± 2.8%）被选为最适活性部位进行后续化学研究。

通过生物活性导向分离和多种色谱技术，研究人员从上述活性部位中共分离鉴定24个化合物，其中余甘子9个（P1–P9）、三敛6个（A1–A6）、火索麻9个（H1–H9）。这些代谢物结构类型多样，包括植物甾醇、羽扇豆烷型三萜及其酯类、木脂素、酚酯、黄酮及相关含氧衍生物。值得注意的是，A1被鉴定为新化合物，命名为demethoxybilimoside A，为一种新的酚苷；P1（stigmastane-3β,6α-diol 3-O-tetradecanoate）此前仅作为不可分离的甾醇酯混合物成分被报道，本研究首次以纯化合物形式分离并表征。

在100 μM浓度下对所有分离化合物进行基于荧光共振能量转移（FRET）的Mpro抑制活性评估，结果显示不同植物来源和结构类型的化合物活性差异明显。余甘子来源的P1、P4（羽扇豆醇）和P2（β-谷甾醇棕榈酸酯）表现出较强抑制，抑制率分别为99.3 ± 2.0%、88.5 ± 0.9%和76.1 ± 1.3%；三敛来源的黄酮类化合物A5（山柰酚）和A6（槲皮素）抑制率高达95.8 ± 1.0%和99.5 ± 1.1%；火索麻来源的H4表现出该组最高抑制率（67.0 ± 0.4%）。P1由于长链甾醇酯骨架在Mpro抑制研究中较为少见，且本研究以其纯化合物形式获得，被优先选作进一步研究，其表观IC₅₀值为86.5 ± 3.8 μM（阳性对照利托那韦IC₅₀为33.2 ± 3.5 μM）。

分子对接研究使用SARS-CoV-2 Mpro晶体结构（PDB ID: 9HAK），先通过重新对接天然配体验证对接方案（RMSD = 0.8 ?，低于2.0 ?阈值）。天然配体对接评分为?9.3 kcal mol^?1，MM-GBSA结合自由能为?108.9 kcal mol^?1，与Gly143、Cys145和His41形成氢键相互作用，并与Gln192形成卤键。P1和P4以及A5、A6也进行了对接分析，其中A5和A6的对接评分分别为?7.4和?7.1 kcal mol^?1，MM-GBSA值分别为?43.8和?45.1 kcal mol^?1，预测与Glu166、Asn142和Thr26形成氢键相互作用。P1对接评分为?5.0 kcal mol^?1，MM-GBSA值为?51.8 kcal mol^?1，保留了与Glu166的氢键相互作用，但其疏水性甾醇酯骨架较大，限制了在催化口袋中的最优适配。

**主要技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）植物材料采集：三敛叶片采自泰国 Uttaradit 省（2023年10月），余甘子茎皮和火索麻根分别采自泰国 Lampang 省（2024年1月和8月），所有物种经 Mahasarakham 大学生物学系 Kanit Wangwasit 助理教授鉴定，凭证标本保存于 Mahasarakham 大学标本馆；（2）溶剂提取与分配：采用甲醇浸提获得粗提物，依次用正己烷、正己烷–乙酸乙酯（1:1）和乙酸乙酯进行液–液分配；（3）色谱分离：综合运用正相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱和反相C18柱色谱进行化合物分离纯化；（4）结构鉴定：使用核磁共振波谱（NMR，500 MHz ¹H和125 MHz ¹³C）、高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）、红外光谱（IR）及二维NMR技术（HMBC、NOESY、COSY）确定化合物结构；（5）活性评价：采用FRET-based酶学实验评估提取物、部位和纯化合物的Mpro抑制活性；（6）分子对接：使用Glide程序对接化合物与Mpro（PDB ID: 9HAK），以Prime MM-GBSA计算结合自由能。

**研究结果分述**

**2.1 提取物生物活性**：在100 μg mL^?1浓度下，三种植物粗甲醇提取物均表现出中等Mpro抑制活性（61.7 ± 1.5%、56.9 ± 3.8%和53.3 ± 1.7%）。溶剂分配后，余甘子的正己烷:EtOAc萃取物、三敛的EtOAc萃取物和火索麻的EtOAc萃取物分别被选为最适活性部位。该结果表明三种泰国药用植物含有值得深入研究的Mpro抑制活性成分。

**2.2 植物化学研究与结构解析**：通过多种色谱方法从三种植物中共分离24个化合物。结构类型涵盖植物甾醇、羽扇豆烷型三萜及三萜酯、色烯-5,8-二酮衍生物、二萜衍生酚类化合物、酚苷、黄酮类、木脂素和单环酚酯等。A1通过HRESIMS确定分子式为C₂₂H₂₆O₁₁，综合1D/2D NMR数据分析确定其为新酚苷，命名为demethoxybilimoside A，与已知化合物bilimoside A（A2）的结构差异仅在于B环上甲氧基的缺失。P1为首次以纯化合物形式分离得到的stigmastane-3β,6α-diol 3-O-tetradecanoate。该结果表明三种泰国药用植物富含结构多样的次生代谢产物。

**2.3 分离化合物生物活性**：在100 μM浓度下进行的FRET筛查显示，P1、P4、A5和A6表现出最强的表观Mpro抑制活性（99.3 ± 2.0%、88.5 ± 0.9%、95.8 ± 1.0%和99.5 ± 1.1%）。P1的表观IC₅₀为86.5 ± 3.8 μM。火索麻来源的H4抑制率最高（67.0 ± 0.4%），表明三萜酯骨架可贡献中等Mpro抑制活性，但活性高度依赖酯取代基和含氧模式。研究结果同时指出，黄酮类化合物可能通过荧光猝灭或非特异性聚集干扰FRET实验，A5和A6的活性应视为初步筛选结果而非确认的Mpro抑制剂。

**讨论总结与研究结论**

研究讨论部分指出，羽扇豆醇（P4）和槲皮素（A6）等化合物已在既往研究中通过分子对接或实验方法被报道为Mpro相互作用代谢物，其文献IC₅₀值因实验条件不同不能与本研究单浓度FRET数据进行直接定量比较。P1由于其长链甾醇酯骨架在Mpro抑制研究中较少被探索，且本研究以纯化合物形式获得，故被优先选作进一步IC₅₀测定和分子对接分析。分子对接验证实验通过重新对接天然配体获得了可靠的对接方案（RMSD = 0.8 ?）。P1虽能与Mpro相结合，但其结合亲和力弱于共晶天然配体，这与其体积庞大且高度疏水的甾醇酯骨架有关。研究同时承认MM-GBSA计算基于单一能量最小化对接构象，未能完全表征蛋白质和配体的柔性和溶剂重组效应，应视为初步的后对接重打分估算。由于缺乏去垢剂对照和正交切割实验，观察到的表观抑制活性不能完全排除聚集相关干扰，山柰酚和槲皮素的FRET活性也可能受到荧光干扰的影响，这些活性应被视为初步筛选结果。

研究结论认为，对泰国采集的余甘子、三敛和火索麻进行植物化学研究获得了结构多样的天然产物，其中多个化合物在本研究FRET筛选条件下表现出初步Mpro抑制作用。通过色谱分离共获得24个次生代谢物，涵盖植物甾醇、羽扇豆烷型三萜、三萜酯、木脂素、酚酯、黄酮及相关含氧化合物。其中demethoxybilimoside A（A1）被鉴定为新酚苷，stigmastane-3β,6α-diol 3-O-tetradecanoate（P1）以纯化合物形式分离。生物活性评估确定了多个显示表观Mpro抑制活性的化合物，P1因其长链甾醇衍生物在Mpro抑制研究中罕见而尤为值得关注，其表观IC₅₀为86.5 ± 3.8 μM并进行了分子对接分析。研究强调需要进一步的生物化学正交验证来确定观察到的表观抑制活性是否代表特异性SARS-CoV-2 Mpro抑制。本研究拓展了泰国余甘子、三敛和火索麻的植物化学知识，为基于天然产物的抗COVID-19先导化合物开发提供了新的化学依据和候选分子。