靶向DYRK1A的吡嗪–胍杂合体用于阿尔茨海默病：合理设计、合成与生物学评价

《RSC Advances》：Targeting DYRK1A with rationally designed pyrazine–guanidine hybrids for Alzheimer's disease: design, synthesis, and biological evaluationOpen Access

　　

双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A）通过调控tau过度磷酸化和神经炎症通路参与阿尔茨海默病（AD）的发病机制，提示DYRK1A是一个重要的治疗靶点。研究人员采用计算与实验相结合的方法，报道了一类低分子量吡嗪-胍分子杂合体作为潜在DYRK1A抑制剂的合理设计、合成与评价。分子对接研究预测了良好的蛋白质-配体相互作用，其中化合物F1、F5和F7表现出最高的结合亲和力（?9.7 kcal mol^?1），而参考抑制剂Harmine为?8.8 kcal mol^?1。稳态荧光进一步证实了蛋白质-配体复合物的形成，其中化合物F7具有最高结合亲和力，K = 1.70 × 10⁶ M^?1。酶抑制实验显示对DYRK1A呈浓度依赖性抑制，化合物F1、F7和F11的IC₅₀值分别低至8.10、12.46和24.05 μM，而参考标准Harmine为1.43 μM。所测化合物对N9小胶质细胞的细胞毒性表明它们大多无细胞毒性，其中化合物F7具有最佳安全性。此外，化合物F1和F7显著降低脂多糖诱导的一氧化氮和活性氧产生，表明其抑制神经炎症反应的潜力。分子动力学模拟进一步证实了蛋白质-配体复合物的稳定性，在模拟过程中激酶活性位点内持续保持接触。计算机模拟理化性质预测表明这些化合物具有类药性和良好的口服生物利用度。然而，所评估化合物预测的血脑屏障渗透性较差，是中枢神经系统暴露的重要限制，并强调需要进一步结构优化以提高脑渗透性。在筛选的化合物中，F7是最有前景的DYRK1A抑制剂，具有低细胞毒性和显著的抗神经炎症作用。本研究结果确定了阳离子杂芳基吡嗪-胍骨架作为开发针对阿尔茨海默病的DYRK1A抑制剂的有用框架。

# 论文解读

## 研究背景

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，也是痴呆的主要原因，表现为进行性记忆、认知和行为能力下降。目前临床药物（如乙酰胆碱酯酶抑制剂、美金刚等）只能改善症状，无法阻止或逆转神经退行性变；近期获批的疾病修饰疗法也仅显示出有限的临床疗效。DYRK1A（dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A）通过磷酸化tau蛋白多个丝氨酸/苏氨酸位点促进神经原纤维缠结形成，并磷酸化淀粉样前体蛋白（APP）Thr668位点增强Aβ生成，在AD发病中发挥关键作用。已知的DYRK1A抑制剂（如Harmine）存在选择性差、脱靶效应和代谢不稳定等问题。吡嗪是一种结构多样且具有良好药理学活性的骨架，而胍是能与酶活性位点形成强静电和氢键相互作用的药效团，但吡嗪-胍杂合体作为DYRK1A抑制剂尚未被系统研究。因此，研究人员设计并合成了一系列吡嗪-胍杂合体，旨在开发新型DYRK1A抑制剂。

## 研究内容

研究人员采用基于结构的杂合设计策略，结合吡嗪核、哌嗪连接臂、胍药效团及多种芳香取代基，设计并合成了11个目标化合物（F1–F11），并通过分子对接、荧光结合研究、酶抑制实验、圆二色谱、细胞实验、分子动力学模拟及理化性质预测进行了系统评估。

## 关键技术方法

主要方法包括：分子对接（AutoDock Vina，使用DYRK1A晶体结构PDB ID: 4YLK）；多步有机合成（亲核取代、Suzuki偶联、Boc脱保护、胍基化）；DYRK1A在大肠杆菌BL21中表达并经Ni-NTA亲和层析纯化；稳态荧光光谱测定结合常数（K）与结合位点数（n）；ATP水解酶抑制实验测定半数抑制浓度（IC₅₀）；圆二色谱（CD）分析蛋白二级结构变化；细胞实验使用N9小胶质细胞系（来自印度NBRC的Anirban Basu教授实验室），采用MTT法检测细胞活力、DCFDA法检测活性氧（ROS）、Griess法检测一氧化氮（NO）；分子动力学模拟（Desmond模块，100 ns）；SwissADME平台预测理化性质与类药性。

## 研究结果

### 2.1 分子对接

分子对接结果表明，所有化合物均能进入DYRK1A的ATP结合口袋。F1、F5、F7的结合自由能均为?9.7 kcal mol^?1，优于参考抑制剂Harmine（?8.8 kcal mol^?1）。以F7为例，其与Asp307、Lys188、Leu241、Ile165形成氢键，与Ser242形成碳-氢键，与Glu203形成卤键，与Phe238存在π–π堆积，并与Val173、Val222、Ala186、Leu294等形成π–烷基/烷基相互作用，这些非共价作用共同稳定了配体-蛋白复合物。

### 2.2 化学合成

通过逐步合成路线成功制备了F1–F11：以哌嗪为起始原料经Boc保护得到中间体2，再与2,6-二氯吡嗪发生亲核取代生成中间体4，随后与取代芳基硼酸进行Suzuki偶联得到中间体5，经Boc脱保护后与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐反应引入胍基。所有化合物经¹H NMR、¹³C NMR和HRMS结构确证。

### 2.3 DYRK1A表达与纯化

在E. coli BL21中经IPTG诱导表达含DYRK1A基因的pCold I载体，菌液裂解后通过Ni-NTA亲和层析纯化，SDS-PAGE显示单一蛋白条带，表明获得高纯度重组DYRK1A。

### 2.4 稳态荧光

荧光滴定实验显示，化合物浓度增加导致DYRK1A内源荧光强度显著下降，表明形成稳定配体-蛋白复合物。经Modified Stern–Volmer方程拟合，F7的结合常数最高（K = 1.70 × 10⁶ M^?1），F1为1.04 × 10⁵ M^?1。F4、F5、F8、F9因在实验条件下DMSO中溶解度差，未能获得可靠参数。荧光结合结果与分子对接预测趋势一致。

### 2.5 酶抑制实验

在ATP水解酶活性实验中，F1、F7、F11对DYRK1A呈浓度依赖性抑制，IC₅₀分别为8.10 μM、12.46 μM和24.05 μM，参考抑制剂Harmine的IC₅₀为1.43 μM。结果显示F1和F7具有较好的DYRK1A抑制活性，与荧光结合实验结论相符。

### 2.6 圆二色谱

DYRK1A的远紫外CD光谱在208 nm和222 nm处呈现两个负峰，表明蛋白具有高α-螺旋含量。加入化合物后，椭圆率随配体浓度增加而改变，但α-螺旋特征峰形基本保留，说明配体结合引起局部构象变化，未破坏整体二级结构。

### 2.7 细胞活力

MTT法检测化合物对N9小胶质细胞活力的影响，24小时处理后F1、F7、F11的IC₅₀分别为167.8、292.0和75.2 μM。F7的IC₅₀最高，表明其细胞毒性最低；F11毒性相对较高。低浓度下三种化合物均具有良好的细胞耐受性。

### 2.8 对LPS诱导的ROS影响

DCFDA实验显示，脂多糖（LPS）刺激显著增加N9细胞内ROS水平。10 μM的F1和F7处理后，LPS诱导的ROS产生明显降低，其中F1的降幅最大；F11虽有下降趋势但无统计学差异。

### 2.9 对LPS诱导的NO影响

Griess实验显示，LPS显著刺激N9细胞释放NO。10 μM的F1和F7处理显著降低NO水平，接近对照水平；F11未表现出显著抑制效果。该结果表明F1和F7能抑制小胶质细胞炎症反应。

### 2.10 分子动力学模拟

对DYRK1A–F7复合物进行100 ns分子动力学模拟。RMSD分析显示蛋白Cα原子波动约1.0–1.5 ?，结构稳定；配体在初期（0–60 ns）有较大波动（2.0–4.0 ?），约60 ns后稳定在1.0–2.0 ?，表明配体获得稳定结合构象。RMSF分析显示配体原子波动极小（0.2–1.2 ?），结合位点相对刚性。回旋半径（rGyr）维持在4.6–4.9 ?，溶剂可及表面积（SASA）、分子表面积（MolSA）和极性表面积（PSA）均保持稳定，进一步验证复合物的稳定性。

### 2.11 理化性质

SwissADME预测显示，F1、F7、F11均满足Lipinski五规则和Veber标准，无PAINS警报，具有良好口服生物利用度评分（0.55）和胃肠吸收。然而，所有化合物的血脑屏障（BBB）渗透性预测较低，这是其作为中枢神经系统（CNS）药物的主要限制，后续优化需降低极性或采用前药策略。

## 讨论与结论

本研究表明，吡嗪–胍杂合体是一种有前景的DYRK1A抑制剂骨架。综合分子对接、荧光结合、酶抑制、细胞实验及MD模拟结果，化合物F7展现出最佳的综合平衡：高DYRK1A结合亲和力、良好的酶抑制活性（IC₅₀ = 12.46 μM）、稳定的蛋白-配体复合物、低细胞毒性以及显著的抗神经炎症作用。F1在酶抑制方面略优（IC₅₀ = 8.10 μM），但在结合亲和力、细胞安全性和整体平衡上不及F7。尽管所有化合物均存在BBB渗透性差的缺陷，但该骨架为后续结构优化（如降低胍基碱性、生物电子等排替换或前药设计）奠定了基础。研究人员认为，吡嗪-胍骨架为开发治疗阿尔茨海默病的新型DYRK1A抑制剂提供了有价值的先导平台。